Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ная цепь расщеплялась быстрее, чем немодифицированная.

Защита ДНК от действия рестриктаз может происходить вследствии ее модификации другими метилазами, узнаваемые последовательности которых полностью или частично перекрываются с субстратным участком исследуемых рестриктаз. Инте-

47

pec представляют те случаи, когда такое метилирование затрагивает другие нуклеотиды, немодифицируемые канонической метилазой. Рестриктазы различаются по чувствительности к такому типу модификации субстрата. Защита ДНК от действия некоторых рестриктаз может происходить вследствии метилирования только определенного нуклеотида в узнаваемой последовательности. Например, BamH I расщепляет последовательности 5'GGATCmC [238, 274] и 5'GGmATCC [98, 125], но не действует на 5'GGATmCC [169]. Последний вариант метилирования узнаваемого участка соответствует каноническому. В отличие от приведенного примера существуют также рестриктазы, ингиби-руемые метилированием нескольких различных оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Например, рестриктазы Xho I и SalG I, узнающие последовательности 5'CTCGAG [145] и 5'GTCGAC [66] соответственно, не расщепляют субстрат, содержащий в вышеуказанных последовательностях метилированный аденин или внутренний цитозин [129, 254].

Обсуждая влияние сайт-специфического метилирования в неканонических положениях узнаваемого участка следует иметь ввиду, что ингибирующее действие на рестриктазы не всегда проявляется по принципу «да» или «нет» [105, 258]. Иногда наблюдается только снижение активности фермента в 5—20 раз [152, 274]. В таких случаях конечный результат может зависеть от условий проведения реакции, времени ее протекания, концентрации фермента. Возможно этим следует объяснить, например, противоречивые данные о том, что RXma I расщепляла 5'CCm5CGGG последовательность в эукариотической ДНК, но не в ДНК Н. parainfluenzae [98, 415, 416].

4.4.2. Чувствительность рестриктаз к природе минорного основания

До недавнего времени специфичность рестриктаз к модификации субстрата изучалась только в отношении местоположения модифицированного основания в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Открытие Ы4-метилцитозина (т4С) [56, 103, 191] поставило вопрос о способности рестриктаз дифференцировать два по разному модифицированные цитозина (N4- и 5-метилцитозин), локализованные в идентичных местах узнаваемой последовательности нуклеотидов. Такие исследования впервые были проведены на примере рестриктаз Mva I и EcoR II, узнающих 5'CC(A/T)GG последовательность. Метилирование внутреннего цитозина в указанном участке по 5-тому положению (образуется 5-метилцитозин) защитило субстрат от действия EcoR II, но не от Mva I [103]. В случае появления в этом же месте №-метилцитозина ДНК становилась устойчивой кдей-

48

ствию обеих исследуемых рестриктаз. Сказанное иллюстрируется схемой, которая приводится ниже.

(перечеркнутой стрелкой обозначено отсутствие действия фермента) .

Оказалось, что аналогичным свойством в отношении некоторых положений участка узнавания обладают также рестриктазы Xma I, Cfr9 I, Sma I, Нра II [105], Ben [191] и предположительно BstN I [258]. Эти данные указывают на больший блокирующий эффект т4С по сравнению с т5С, так как известна лишь одна рестриктаза, способная расщеплять сайт при наличии m4C — Msp I [105]. Целая группа ферментов блокируется при наличии метилированных цитозинов любой природы в идентичных положениях узнаваемого участка [102, 103, 105]. Таким образом эти ферменты оказались неспособными дифференцировать ш5С и т4С.

Выше были рассмотрены общие вопросы, касающиеся проявлений специфичности рестриктаз по отношению к природным модификациям субстрата. Ниже излагаются сводные данные и некоторые следующие из них частные обобщения.

4.4.3. Сводные данные о чувствительности рестриктаз к модификациям субстрата

Чувствительность рестриктаз к различным модификациям субстрата представляет собой важное проявление их специфичности. Поэтому такие данные регулярно обобщаются и публикуются. Выполняется эта работа в основном Макклелландом [252, 253, 258]. В табл. 12 представлены сводные данные, касающиеся характеристики ферментов рестрикции II типа [258]. Они обобщают совокупность известных данных о чувствительности рестриктаз к метилированию субстрата. Ниже приводятся некоторые частные обобщения, составленные на основе данных, приведенных в табл. 12.

RMval REcoRE

RMva I

4-5933

49

Таблица 12

Чувствительность эндонуклеаз рестрикции к метилированию субстрата

Рестриктаза Узнаваемая последовательность Расщепляемые последовательности Нерасщепляемые последовательности

AacI CCWGG C°5CWGG ?

Aatl AGGCCT ? AGGm5CCT

AGGCm5CT

AccI GTMKAC ? GTMKm6AC*

GTMKAm5C

AccII CGCG ? m5CGCG

АссШ TCCGGA Tm6CCGGA TCCGGm6A

TCm5CGGA

АШ GGWCC GGWCm5C ?

Aha 11 GRCGYC6 ? GRm5CGYC

GRCGY^C

AIuI AGC Г ? »6AGCT

AGm4CT

AGffl5cr+

AGhm5CT

Alwl GGATC ? GGm6ATC

GGATm4C

Amal TCGCGA TCGCGm6A ?

AosII GRCGYC ? GRm5CGYC

Apal GGGCCC ? GGGm5CCC#

GGGCCm5C

ApaLI GTGCAC GTGCm6AC

Apyl CCWGG Cm5CWGG5 m5CCWGG

AquI CYCGRG ? »5CYCGRG*

Asp718I GGTACC GGTmeACC6 GGTACm5C

GGTAm5Cm5C6

AsuII TTCGAA TTm5CGAA ¦>

AtuCl TGATCA TGm6ATCA

Aval CYCGRG Cm5CCGGG m5CYCGRG

CYm5CGRG

CTCGm6AG6

Avail GGWCC ? GGWm5CC

GGWCm5C

GGWhm5Chm5C

Ball TGGCCA ? rGGm5CCA*

TGGC-^CA6

BamHl GGATCC GGATCm5C GGATm4CC*

GGm6ATCC GGATm5CC

GG»6ATCm5C GGAThm5Chm5C

BamFI GGATCC GGm6ATCC ?

BamKI GGATCC GGm6ATCC ?

Banl GGYRCC6 GGm5CGCC ?

Banll GRGCYC ? GRGm5CYC

Banlll ATCGAT ? ATCGm6AT

Bbvl GCWGC ? Gm5CWGC*

Bell TGATCA6 TGATm5CA TGm6ATCA

TGAThm5CA

Ben! CCSGG m5CCSGG Cm4CSGG*

BepI CGCG ? m5CGCG

Bgll GCCN5GGC GCm5CN5GGC Gm5CCN5GGC.

50

Продолжение таблицы 12

Рестриктаза Узнаваемая Расщепляемые Hep зацепляемые

последовательность последовательности последовательности

GCCN5GGm5C6

BglH AGATCT6 AGm6ATCT AGATm5CT

AGAThm5CT

BinI GGATC ? GGm6ArC

Bme216I GGWCC ? GGWCm5C

Bsp 12861 GDGCHC ? GDGm5CHC

BspHI TCATGA ¦> TCATGm6A

BspMI ACCTGC ? ACCTG»5C

BspMII TCCGGA TCCGGm6A Tm5CCGGA

ТСш5ССОА

BspNI CCWGG ffl5CCWGG ?

Cm5CWGG

BstYI RGATCY RGm6ATCY RGATm4CY

BspXI ATCGAT ? ATCGm6AT

BspXII TGATCA ? TGm6ATCA

BssHII GCGCGC6 ? Gm5CGm5CGC

BstI GGATGC GGm6ATCC GGATm*CC

GGATCm5C GGATm5CC

BstBI TTCGAA ? TTCGmeAA

BstEII GGTNACC GGTNAm5Cm5C6 GGTNAhm5Chm5C

BstEII I GATC6 ? Gm6ATC

BstGI TGATCA ? TGm5ATCA

BstNI CCWGG6 m5CCWGG6 hm5Chm5CWGG

Cm5CWGG

mSCm5CWGQ6

BstUI CGCG ? m5CGm5CG

BstXI

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)