Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

дной стороны узнаваемой последовательности на расстоянии в разных цепях, равном 9 и 13 нуклеотидов:

5'-GGATGNNNNNNNNN*

З'-CCTATNNNNNNNNNNNNN*

Как в отношении типа построения узнаваемого участка, так и характера расщепления субстрата, обсуждаемые ферменты напоминают рестриктазы III типа (см. табл. 1). Только в отличии от последних, специфические эидоиуклеазы дают исчерпывающее фрагментирование субстрата по всем узнаваемым участкам.

4.4. Специфичность рестриктаз в отношении природных модификаций основания

Метилирование оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов способно предотвратить ее расщепление рестрик-тазой. Такая модификация субстрата осуществляется метилаза-ми и лежит в основе механизма защиты клеточной ДНК от сопряженной специфической эидоиуклеазы.

Долгое время было общепринятым мнение, что модификации в составе ДНК подвергаются только аденин и цитозин с образованием 6-метиладенина (т6А) и 5-метилцитозииа (т5С) [126, 129, 252]. В последнее время появились данные о существовании специфических метилаз, способных метилировать гуа-ниновые остатки по 7-му положению [278, 279] и цитозин по N4-положению (miC) [56, 103, 191], и продемонстрировано их участие в защите ДНК от действия рестриктаз. Последующие исследования раскрыли широкую таксономическую распространенность ДНК-[№-цитозин] -метилтрансфераз [56, 103, 191], а также т4С [128, 130] среди бактерий, что позволяет считать т4С наряду с упомянутыми т5С и т6А обычным минорным компонентом бактериальной ДНК. В настоящее время чувствительность рестриктаз рассматривается в отношении упомянутых трех типов метилирования ДНК [258]. Кроме того представляют интерес и другие природные модификации ДНК. Имеются в виду «необычные» основания, которые включаются в состав ДНК в ходе репликации. К таким относится 5-гидроксиметилцитозин, замещающий все цитозиновые остатки в геноме Т-четных и некоторых других фагов [37, 230, 402]. Эти 5-гидроксиметилцитозино-вые остатки кроме того подвергаются глюкозилированию. ДНК, содержащая 5-гидроксиметилцитозин, является устойчивой к действию большинства рестриктаз. В последнее время данные о

45

чувствительности специфических эндонуклеаз к 5-гидроксиме-тилцитозину также стали приводиться в сводных таблицах, характеризующих влияние различных природных модификаций субстрата на его подверженность расщеплению ферментами рестрикции (см. разд. 4.4.2). Влияние других необычных природных модификаций фаговых ДНК (замещение тимина иа 5-гидроксиметилурацил — фаги В. subtilis SPOl, SP8 и др., на урацил — фаги PBS1 и PBS2, на 5-дигидроксипентилурацил, который подвергается пострепликативному глюкозилированию, фосфоглюконированию и т. д.) [198, 214, 366] на способность рестриктаз расщеплять такие субстраты мало изучено. На основе проведенных исследований делаются выводы о резистентности обсуждаемых субстратов к действию подавляющего большинства исследованных рестриктаз [182].

Особое место среди всех исследованных рестриктаз занимает Dpn I, которая расщепляет ДНК только при наличии б-метил-аденина в обоих цепях узнаваемой последовательности 5'Gm6 АТС [218, 219]. Немодифицированная или гемиметилиро-ванная (содержащая одну метилированную, другую неметили-рованную нить) ДНК устойчива к действию этого фермента [380]. В настоящее время обнаружены еще б рестриктаз, характеризующиеся идентичной с Dpn I субстратной специфичностью как в отношении узнаваемой последовательности, так и ее модификации—Cfu I, NmuE I, NsuD I, Nan II, NgoIII, NmuD I [319].

В литературе имеются данные, что Ару I преимущественно расщепляет ДНК в том случае, когда в ее узнаваемой последовательности 5'CC(A/T)GG цитозиновый остаток, расположенный рядом со средним основанием является метилированным [304]. «Преимущественно» означает тот факт, что и неметилиро-ванная последовательность подвергается (хотя и очень слабому) расщеплению этим ферментом.

Вполне вероятно, что существует и больше аналогичных эндонуклеаз, но отличающихся от рассмотренных структурой узнаваемого участка. Их обнаружению может препятствовать использование в качестве субстратов ДНК вирусов и плазмид, размноженных в штаммах Е. coli, характеризующихся содержанием ограниченного круга метилаз (dam — узнает 5'GATC и dcm — 5'CC(A/T)GG). Поэтому для поиска таких ферментов следовало бы разработать специальные методические подходы.

Возможно совершенно новый вариант специфичности скрывается за феноменом рестрикции фагов у микоплазмы Achole-plasma landlawii JAl [349]. Этот штамм ограничивал фаги, содержащие 5-метилцитозин в любом окружении. Таким образом эта система рестрикции проявляет специфичность к т5С, а не к какой-то определенной последовательности нуклеотидов, содержащей это минорное основание. Вопрос о том, имеется ли в клетках эндонуклеаза специфически расщепляющая ДНК, со-

46

держащую m5C пока не исследован. Обсуждаемое явление в*, какой то мере феноменологически напоминает элиминацию из клеток некоторых штаммов Е. coli ДНК, содержащей метилированные основания [303]. Однако, в последнем случае идентифицированные системы рестрикции (МсгА, МсгВ и Мгг) проявляют специфичность к ближайшему соседу минорного основания, чего не наблюдается у A. landlawii. Пока для Е. coli также не продемонстрировано, что наблюдаемый феномен обусловлен наличием в клетках специфических эндонуклеаз.

4.4.1. Специфичность рестриктаз по отношению к, местоположению модифицированного основания

Рестриктазы проявляют специфичность и по отношению к местоположению модифицированных оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов. Во всех исследованных случаях было обнаружено, что метилирование, осуществляемое штаммо-специфической метилазой, защищает ДНК от расщепления сопряженной рестриктазой [98, 252, 319]. Этот тип модификации Макклеландом [252] был назван «врожденным» («cog-nate»). В настоящем обзоре для его обозначения будет принято название — каноническое метилирование. Оно проявляется в метилировании симметрично расположенных строго определенных оснований в каждой цепи узнаваемой последовательности нуклеотидов. Например, специфическая метилаза Нра II метилирует внутренний цитозин в последовательности 5'CmC GG в

3'G GmCC

результате чего ДНК становится устойчивой к действию рестриктазы Нра II [238, 302].

Показано, что для защиты субстрата достаточным является наличие минорного основания только в одной из цепей в узнаваемой последовательности нуклеотидов [329, 380], т. е. в этих случаях не наблюдалось фрагментирования ДНК. Вместе с тем имеются данные о том, что некоторые рестриктазы в случае гибридного дуплекса ДНК, содержащего одну метилированную, другую неметилированную нить, способны надрезать немоди-фицированную цепь [94, 105, 210, 358]. Скорость расщепления немодифицированной нити в гемиметилированной ДНК является ниже, чем при расщеплении двухнитевого немодифицированно-го субстрата [358]. Исключением во всех отношениях является RMsp I, расщепляющая канонически гемиметилированную узнаваемую последовательность 5/mCCGG [105]. Кроме того метили-

3' GGCC

рован

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)