Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ательности нуклеотидов [112, 141, 170, 297, 346, 397]. Примеры таких «наборов» представлены в табл. 10. Последовательности, производные канонических, расщепляются с неодинаковой скоростью. В случае EcoR I* активности наблюдается следующая градация скоростей расщепления: 5'GAATTC (каноническая) > GGATTT>АААТТТ> АААТТС, ТААТТС [397].

41

Таблица 10

Структура узнаваемых участков, служащих субстратом в случае релаксированной специфичности

Фермент Каноническая узнаваемая последовательность Релаксированная узнаваемая последовательность Источник информации

XYZZ'Y'X' NYZZ'-Y-x-a) XNZZ'Y'X' XYNZ'Y'X' XNZZ'Y'N NYZZ'-Y'N Hind III A AQCTT GAGCTC AGGCTT AATCTT [273]

ATGCTT Pvu II CAG CTG CCGCTG CATCTG [2721

CACCTG EcoR V GAT АТС AATATC GGTATC GACATC [1631

TATATC GCTATC GAAATC

CATATC GTTATC OAGATC 6)

BamH I G GATCC CGATCC GAATCC [209]

AGATCC

TGATCC

BamH I GGATCC GAATCC GGCTCC [141]

GGGTCC EcoR I GGTTCC

G AATTC AAATTC GGATTT AAA- [397]

TAATTC TTT

CAATTC

а) — типы построения узнаваемых участков; X и Y — нуклеотиды определенной структуры; X и X', Y и Y' и т. д. — комплементарные нуклеотиды; N— любой нуклеотид;

б) — EcoR V* расщепляет данную последовательность, только в случае ¦отсутствия dam специфического метилирования (5'Gm6ATC)

Повсеместно распространено мнение, что обсуждаемое явление обусловлено действием факторов инкубационной среды, влияющих на точность узнавания субстрата рестриктазами, а не наличием в исследуемых препаратах разных по специфичности ферментов. В пользу этого вывода говорят данные, полученные с использованием гомогенных препаратов рестриктаз [112, 140, 170], совместное хроматографическое фракционирование «строгой» и «ослабленной» активностей [373] и аналогичное действие различных факторов (глицерин, органические растворители, ионы марганца и т. д.) на эндонуклеазы, обладающие различной субстратной специфичностью [112, 140, 170, 181, 236, 297, 397].

Способность рестриктаз проявить пониженную субстратную специфичность изучена на небольшом числе примеров. Не исключено, что эта особенность характерна для многих (если не всех) специфических эндонуклеаз.

42

4.3. Место расщепления субстрата

Важным функциональным проявлением рестриктаз является место расщепления ДНК в отношении узнаваемого участка. Это свойство также характеризуется большим разнообразием вариантов. Большинство специфических эндонуклеаз расщепляют ДНК внутри участка узнавания. Возможные варианты расщепления можно рассмотреть на примере гексануклеотидных палиндромов:

Рестриктаза Узнаваемая последов ательиость Структура концов Источник информации

Xma I 5'—C|CCGGG 5' — выступающий Г132]

Asu II 5'—TT|CGAA тетр<ануклеотндный 5' —выступающий [120]

Sma I 5 —CCCIGGG динуклеотидный Полиостью [319]

Pvu I 5'CGAT|CG спареииый 3' — выступающий [144]

Kpn I 5'—GGTAG|C динуклеотидный 3' — выступающий тетрануклеотидный [374]

Таким образом, при расщеплении двухнитевой ДНК могут образоваться концы трех структурных типов. Если разрыв происходит посредине узнаваемой последовательности, то образуются фрагменты с полностью спаренными («тупыми») концами. В тех случаях, когда расщепление ДНК происходит в стороне от оси симметрии, образуются выступающие однонитевые концы, получившие название «липких», т. е. способных спариваться с комплементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате ее разрыва. При расщеплении одними рестриктазами образуются фрагменты с 5'-выступаю-щими липкими концами. Другие рестриктазы дают фрагменты с З'-избыточностью. Число нуклеотидов в однонитевом конце может варьировать от 5-ти — EcoR II [82], до одного ScrF I [135].

Вариация характера расщепления участков узнавания внесла некоторые поправки и в понятие изошизомерии. Были выявлены рестриктазы, узнающие идентичные последовательности, но различающиеся по месту их расщепления. Например, рестриктазы Sma I и Xma I узнают одинаковые последовательности нуклеотидов, но первая из них при разрыве ДНК образует фрагменты с тупыми концами [319], а вторая расщепляет узнаваемый участок с образованием 5'-выступающих тетрануклео-тидных концов [132]. Такие изошизомеры было предложено называть ложными [49],

43

Думается, что для обозначения рестриктаз, узнающих одинаковые последовательности нуклеотидов, но расщепляющих их в разных местах, вполне приемлемым является термин альтернативные прототипы (alter — один из двух) [102]. Он позволяет подчеркнуть «прототипность» таких ферментов как в отношении функционального проявления, так и следующих из этого различных возможностей в случае их применения в качестве аналитических реагентов. Наличие в термине ложный изошизомер (изос — равный, схизос—расщепляю) [49] последнего слова как бы стушевывает эту разницу.

Рассмотрение литературных данных убеждает, что истинные изошизомеры встречаются чаще, чем альтернативные прототипы. Последние перечислены в табл. 11.

Таблица It

Альтернативные прототипы рестриктаз

Узнаваемая последовательность Варианты расщепления Название фермента Источник информации 5'—GATC 5'—+GATC Mbo I [139]

5'—GmA+TC Dpn I 138]

5'—GCGC 5'—GCG+C Hha I '3201

5'—G+CGC HinP I ;з401

5—CCCGGG 5'—CCC+GGG Sma I [132, 3191

5'—OCCGGG Xma I [132]

5'—GGCGCC 5'—GG+GGCC Nar I 319]

5'—GGCG+CC Bbe I 205]

5'—GGC+GCC Eco78 I [21]

5'-CC(A/T)GG 5'—+CC(A/T)GG EcoR II [82]

5'—ССЧ А/Т) GG BstN I .3191 5'—PuGGNCC- 5'—PuG+GNCCPy Dra 11 [122] Ру

5'—PuGGNC*CPy Pss I [319] 5'—GGTACC 5'—GGTAC+C Kpn I [374]

5-_ GiGTACC Asp718 I [87]

5'—GAGCTC 5'—GAGCT+C Sac I [319]

5'—GAGtCTC Ecll36 II 319]

5'—CCNGG 5'—CC+NGG ScrF I 1351

5'—^CCNGG Sso II [36, 50] 5'CTCGAG 5'—C*TCGAG Xho I [145]

5'—CTOGAG Sci I [319] Расщепление ДНК некоторыми рестриктазами, узнающими разорванные палиндромные последовательности (см. табл. 8„ типы 15—16), происходит в области, разделяющей симметричные части узнаваемой последовательности. Например, рестриктаза Sfi I [301] расщепляет ДНК следующим образом:

5'-GGCCNNNN+NGGCC

З'-CCGGN+NNNNCCGG

В настоящее время также известны 43 рестриктазы, которые расщепляют ДНК за пределами узнаваемых участков. Все они.

44

(за исключением Gsu I, Fsf I, Gdi II, Pie I, Bbv I и его изошизо. мера AlwXI) узнают несимметричные последовательности нуклеотидов (табл. 8, типы 33—36). Расстояние точки разрыва от узнаваемого участка, а также ее ориентация являются строго определенными для каждой рестриктазы. Например, рестриктаза Fok I [359] расщепляет ДНК с о

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)