Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

разделенный двумя расположенными в центральной части основаниями фиксированной природы GG/CC или GA/TC.

Другой вариант разорванных пента- и гептануклеотидных палиндромов представляют последовательности, характеризующиеся менее строгим порядком построения (табл. 8, типы 9 и 11). В центре этих последовательностей допускается присутствие любой нуклеотидной пары, как А/Т, так и C/G. Поэтому субстратом для каждой рестриктазы этой группы является не одна, а две последовательности, различающиеся средней парой нуклеотидов. Как видно из данных, представленных в табл. 8, всего известно 62 рестриктазы, узнающие 6 из 16 возможных пентануклеотидов и 29 ферментов, субстратом для которых является 3 различных гептануклеотида обсуждаемого типа.

Разнообразие разорванных палиндромных последовательностей узнаваемых рестриктазами, не ограничивается вышеуказанными вариантами. Недавно обнаружены эидоиуклеазы Nla IV [300] и Sec I [107], узнаваемые последовательности которых можно характеризовать как тетрануклеотидные палиндромы, разделенные двумя любыми основаниями: 5'-GG(N)2CC и 5'-CC(N)2GG (табл. 8, тип 10). Открыты также рестриктазы, узнающие разорванные гексануклеотидные палиндромы (табл. 8, типы 12—16). Как видно, число любых нуклеотидов, разделяющих симметричные части узнаваемой последовательности, варьирует от 3 до 9. Однако, их число в каждом конкретном случае является строго фиксированным, т. е. рестриктазы не узнают последовательностей палиндромные части которых разделены меньшим или большим числом несимметричных оснований. К настоящему времени известно 22 фермента, узнающие 11 различающихся по структуре уникальной части разорванных гексануклеотидов.

Среди рестриктаз обсуждаемой группы особенно выделяется последовательность нуклеотидов, узнаваемая рестриктазой Sfi I [301] (табл. 8, тип 17). Она представляет собой октануклео-тид, разделенный 5-тью любыми основаниями: 5'-GGCC (N)5GGCC. Это самая протяженная последовательность среди всех идентифицированных участков, узнаваемых специфическими эндонуклеазами.

Разнообразие типов построения участков, узнаваемых рестриктазами, дополняют так называемые «вырожденные» палиндромы, в определенных позициях которых допускается присут-

39

ствие нескольких альтернативных оснований. В настоящее время идентифицирован пока единственный вырожденный тетрануклеотид (5'-PuGCPy), являющийся субстратом для 6 ферментов (табл. 8, тип 18). Остальные 13 таких типов представлены гексануклеотидными последовательностями, узнаваемыми 122 ферментами (табл. 8, типы 19—31). Еще два варианта типов построения узнаваемых участков занимает промежуточное положение между разорванными и вырожденными последовательностями, поэтому выделены в отдельную I г группу. Представители этой группы PpuM. I [319] и Dra II [122] узнают гептануклеотидные последовательности: 5'-PuGG(A/T)CCPy и 5'-PuGGNCCPy соответственно. Рестриктазы, представленные типами 18—25 и 32—33, в местах «вырожденности» способны отличить пурины от пиримидинов, но не G от А, или С от Т. Поэтому субстратом для ферментов этой группы служит не одна, а несколько близких по структуре последовательностей нуклеотидов, в том числе и истинные палиндромы. Например, на основе общей структуры участка 5'-GPuCGPyC, узнаваемого рестриктазои Асу I [121], могут быть написаны 4 различные последовательности: 5'-GGCGCC, 5'-GACGCC, 5'-GGCGTC и 5'-GACGTC. В действительности этот фермент узнает только три последовательности, так как 2-ая и 3-тья из них являются комплементарными.

Другие варианты вырожденных гексануклеотидных палиндромов в табл. 8 представлены 26—31 типами построения. Для них характерна возможность наличия в определенных местах как пурина, так и пиримидина, природа которых для каждого конкретного узнаваемого участка является фиксированной. Так, например, в последовательности 5'-(A/T)GGCC(A/T), узнаваемой рестриктазои Нае I [319], в первой и последней позиции может находиться аденин или тимин в любом сочетании. Таким образом эта рестриктаза узнает три, различающиеся по структуре участка: 5'-TGGCCA, 5'-AGGCCA и 5'-AGGCCT.

Среди всех рестриктаз, узнающих «вырожденные» гекса-нуклеотидные палиндромы, особенно выделяется Sdu Г (тип 31), в двух местах узнаваемого сайта селективно дискриминирующая только один из четырех возможных нуклеотидов: 5'-G(G/A/T)GC(C/A/T)C [192]. Таким образом этот фермент способен расщеплять субстрат в 6-ти различающихся по структуре участках.

Среди охарактеризованных специфических эндонуклеаз рестрикции также имеется группа ферментов, узнающих несимметричные последовательности нуклеотидов (табл. 8, типы 34—37). Эти участки по своей структуре напоминают последовательности, узнаваемые рестриктазами III типа (см. табл. 1). Всего идентифицировано 58 таких ферментов, узнающих 22 различных последовательностей.

40

Уже сейчас разнообразие нуклеотидных последовательностей, узнаваемых специфическими нуклеазами, представлено большим числом вариантов. Работа по поиску рестриктаз далеко не завершена. С каждым годом появляются ферменты с новой субстратной специфичностью и пока не видно признаков снижения темпов роста их числа (см. табл. 2). Вариабельность структуры узнаваемых последовательностей в настоящее время уже такова, что кажется вполне вероятным со временем обнаружить рестриктазу для любой последовательности нуклеотидов, по меньшей мере являющейся производным типов, представленных в табл. 8. Интенсивное развитие работ по поиску новых ферментов рестрикции позволяет надеяться, что со временем будет получен ответ и на этот вопрос.

4.2. Релаксированная специфичность рестриктаз

Еще одним проявлением специфичности рестриктаз, имеющим непосредственное отношение к структуре узнаваемых участков, является свойство снижать субстратную специфичность, т. е. производить рсщепление ДНК в участках, отличающихся по структуре от канонической последовательности, узнаваемой ферментом. Это явление было зарегистрировано в случае рестриктаз EcoRI [236, 297, 373], BamHI [140, 236], Bsu I [170], Hhal [236], Hind III [181], Tthlll I [346] и некоторых других ферментов [112, 236]. Пониженная субстратная специфичность (релаксированная, «звездочная» — обозначается, например, EcoR I*) проявляется при определенных условиях проведения ферментативной реакции. В первую очередь они заключаются в использовании избытков рестриктаз. Ряд факторов — изменение рН и ионной силы инкубационной среды, замена ионов магния на некоторые другие ионы двухвалентных металлов, добавление органических растворителей (глицерин, диметилсульфоксид, этанол и т. д.) способны стимулировать проявление пониженной субстратной специфичности рестриктаз [140, 170, 181, 236, 248, 297, 373]. Они никогда не реализуется в исчерпывающем фрагментировании ДНК (не наблюдается эквимолярности между продуктами реакции).

Исследования субстратной специфичности рестриктаз в условиях, обеспечивающих ее изменение, позволили определить, что в этом случае ферменты узнают наборы близких по структуре участков ДНК, являющихся производными канонической узнаваемой последов

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)