Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ые последовательности, в которых в среднем положении может находиться любой из четырех нуклеотидов (например, 5'CCNGG). С статистической точки зрения, частота появления таких последовательностей в ДНК должна быть идентичной таковой для тетрануклеотидов. Поэтому приходится допускать, что отбором каким-то образом дифференцируются метилированные тетрануклеотиды и пентануклеотиды обсуждаемой структуры или что такие сайты тоже подвергаются частичной элиминации.

Среди таксонов, представленных относительно многочисленными группами продуцентов, выделяется род Bacillus, в котором, как и в случае Е. coli охарактеризовано большое число —

29

190 рестриктаз (табл. 6). Среди них 68 (36%) являются ферментами, узнающими тетрануклеотидные последовательности. У Moraxella таких ферментов имеется 11 из 16, (68,8%), у Haemophilus— 16 из 42 (38,1%). Вместе с тем, встречаются роды, у которых, как и у энтеробактерий, таких рестриктаз не обнаружено. Имеется в виду Acetobacter — охарактеризовано 13 рестриктаз, Bifidobacterium—14, Herpetosiphon—16, Nostoc — 29 и Xanthomonas — 19.

Рассмотренные данные говорят в пользу возможного существования таксоноспецифичности рестриктаз, выражающейся если и не в абсолютной ограниченности распространения в определенных таксонах ферментов, узнающих тетрануклеотидные последовательности, то хотя бы относительной. Следовательно, если в штаммах Е. coli и содержатся такие рестриктазы, то они встречаются исключительно редко. Строго говоря, этот вывод справедлив по отношению к специфическим эндонуклеа-зам, содержание которых в, клетках является достаточным для их выявления и последующего изучения. Но пока только они и имеют практическое значение. Что же касается теоретической стороны вопроса распространения рестриктаз, то вполне вероятно, что часть имеющихся продуцентов этим свойством не обладает и поэтому выпадает из дальнейших исследований. Формально не исключено, что среди таких «теневых» рестриктаз имеются и тетрануклеотидузнающие.

Если вернуться к вопросу о строгой таксоноспецифичности. некоторых рестриктаз, представляющей другой аспект обсуждаемой проблемы, то следует отметить, что он еще более трудно доказуем, чем вопрос об ограниченной вариабильности субстратной специфичности. В 1976 г. были охарактеризованы 22 рестриктазы с различной субстратной специфичностью [312]. Среди них 14 прототипов встречались только в одном штамме. К концу 1988 г. из прототипов, обнаруженных в 1976 г., только один (Нае I) не имел изошизомера [319]. Таким образом, существующая тенденция появления рано или поздно изошизоме-ров прототипов говорит в пользу предположения об отсутствии (или по меньшей мере ограниченности) строгой таксоноспецифичности рестриктаз и скорее всего можно говорить о разной распространенности изошизомеров определенных типов специфичности.

В литературе имеется публикация МакКлелланда [252], посвященная изучению взаимосвязи между G-f-C составом ДНК продуцентов рестриктаз и участков узнаваемых этими ферментами (присущим данным клеткам). В результате компьютерного анализа были установлены интересные закономерности: 1) почти все рестрикционные системы, характеризующиеся G+C богатыми тетрануклеотидными узнаваемыми участками обнаруживаются в А+Т богатых видах микроорганизмов; 2) G+C богатые гексануклеотидные узнаваемые последовательности прак-

30

тически иключительно сосредоточены в G+C богатых геномах; 3) большинство А+Т богатых гексануклеотидных узнаваемых участков сконцентрировано в А+Т богатых микроорганизмах. Такое распределение в значительной мере выравнивает частоту встречаемости сайтов рестриктаз в геноме клеток хозяинов. Оставляя в стороне причины этого явления, можно рассматривать открытую закономерность как одно из проявлений таксоноспецифичности рестриктаз.

Традиционным подходом в опытах по поиску продуцентов рестриктаз является изучение с этой целью немногочисленных групп штаммов (даже отдельных штаммов) различной таксономической принадлежности. Исключением является рассмотренная в данном разделе работа [189], заключавшаяся в систематическом изучении групп штаммов одного вида, которое было выполнено на примере Е. coli, С. freundii и К. pneumoniae. Такое одновременное исследование больших групп (864, 152 и 86 соответственно) штаммов одного вида в практике поиска продуцентов рестриктаз было выполнено впервые. Довольно неожиданным следует считать обнаружение в отдельных видах столь большой вариабильности субстратной специфичности рестриктаз, равняющейся 11 разным вариантам из 40 охарактеризованных у С. freundii и 28 из 123 у Е. coli. Обнаруженными типами субстратной специфичности ограничивается известная изменчивость этого признака в виде С. freundii. В Е. coli, кроме ферментов, представленных в рассматриваемой публикации [189], были выявлены еще 6 ферментов с отличающейся специфичностью— EcoICR I (изошизомер Sac I) [360], Eci I [319], EcoNI [319], ЕсоОЮЭ (изошизомер Dra II) [261], EciE I (изошизомер Ара I) [319], EcoT22 I (изошизомер Ava III) [262]. Хотя данных о вариабильности обсуждаемого признака в других видах микроорганизмов мало (табл. 7), они не противоречат предположению, что она является характерной не только для Е. coli и С. freundii.

Проведенные исследования фундаментального характера, касающиеся закономерностей распространения рестриктаз в царстве прокариотических микроорганизмов [189], и их выводы имеют непосредственное отношение к решению прикладных задач.

На основе полученных данных напрашивается вывод о том,, что стратегически правильным было бы при планировании опытов по поиску рестриктаз вовлекать в круг проверяемых штаммов представителей разных таксонов, но изучать их на примере значительно более многочисленных групп, чем это принято сейчас в мировой практике. В пользу выдвигаемой рекомендации говорят нижеизложенные аргументы.

Данные, полученные при изучении Е. coli, демонстрируют определенную ограниченность вариантов субстратной специфичности— в этом виде выявлена только незначительная часть спе-

31

цифичностей рестриктаз (всего 34) из общего числа известных (всего 143) и вообще не обнаружено ферментов, узнающих тетрануклеотидные последовательности. Если в дальнейшем изучать только этот вид, то не исключено, что такая «монотонность» сохраниться. Возможно, какая-то ограниченность характерна и для других вариантов специфичности (внутри пента-гек-са-гептануклеотидных последовательностей). Ее наличие еще более (не считая отсутствия или редкой встречаемости узнающих тетрануклеотиды рестриктаз) сузило бы вариабильность субстратной специфичности обнаруживаемых рестриктаз, что в опытах по их поиску является нежелательным. С другой стороны, данные, полученные на примере многочисленных штаммов Е. coli, а также сведения представленные в табл. 7, свидетельствуют об относительно большой вариабильности специфичности рестриктаз в отдельных таксонах, которая оправдывает проведение таких исследований. Поэтому рекомендуется вовлекать в поиск штаммы разных видов (уменьшение вероятности «монотонности»), но для более полного исполь

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)