_ + НСОН-* ? ? + НСН + НОН

—ьм —ъ

Восстановление дисульфидной группы редуктазы может совершаться за счет восстановленной формы тиоредоксина (гл. 24). Таким образом, полная последовательность выглядит следующим образом:

тиореВоксин- тиореЭогссин рибонуклеотиО-

реоуктаза реВуктаэа

13.5.2. Восстановление сульфата

Восстановление сульфата характерно для метаболизма многих бактерий, водорослей и растений, но не животных. В начальной стадии происходит образование из АТР и сульфата фосфоадено-зиндифосфосульфата (PAPS, гл. 20). Именно в такой форме сульфат восстанавливается бактериями; в клетках водорослей и высших растений восстановлению предшествует гидролитическое отщепление 3-фосфатной группы PAPS, в результате чего образуется аденозиндифосфосульфат (APS). В обоих случаях эфир сульфата реагирует с восстановленным тноредокснном (I) (гл. 24):

/sh , /s-S07 2 /s

т + r—о—so§--» roh + г —>- г I -f hsoj

\sh xsh \s

I II III

с образованием продукта (II), претерпевающего различные превращения. У некоторых водорослей, например Chlorella, продукт II

32*

500

[II. МЕТАБОЛИЗМ

S—SH

восстанавливается неизвестными механизмами до ?? и прямо

\SH

используется для синтеза цистеина (гл. 20). Большинство бактерий, однако, катализирует реакцию (2), в результате образуются неорганический сульфит и окисленный тиоредоксин, который может снова восстанавливаться вышеописанным способом.

Неорганический сульфит ассимилируется посредством восстановления до сульфида S2~, который может использоваться в синтезе цистеина (гл. 20). Это шестиэлектронное восстановление катализируется одним ферментом — сульфитредуктазой, которая относится к числу наиболее сложных ферментов. Сульфитредуктаза катализирует реакцию, которую можно записать в общем виде следующим образом:

3NADPH-f-3H+-t-SOr -»- 3NADP+ + S2- + 3H,0.

Выделенная из Е. coli сульфитредуктаза имеет мол. массу 670 000 и субъединичную структуру ctsp^. Каждый ?-димер содержит один FAD и один FMN, тогда как каждая ?-цепь содержит одну (Fe4S4)-группу и одну молекулу сирогема, структура которого показана ниже:

СООН

сн, соон

H9G СН™

I I 2

НООС соон

сирогем

Сирогем — это железотетрагидропорфирин типа изобактерио-хлорина; два соседних пиррольных кольца полностью восстановлены, и каждый пиррол содержит один остаток пропионовой и о тин остаток уксусной кислоты в боковых цепях; следовательно, сирогем — производное уропорфирина (гл. 22).

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

501

Перенос электронов происходит в соответствии со следующей линейной последовательностью:

NADPH FAD —FMN -—? Fe4S4 —гем —SO|"

NADPH передает пару электронов к FAD, от которого она быстро переносится к FMN. Если только 1 моль NADPH в расчете на 1 моль гема добавляется к ферменту, образуется стабильная форма FAD—FMNH-—Fe4S4—гем—,Fe2+. В присутствии избытка NADPH все компоненты полностью восстанавливаются. Гем, который медленно самоокисляется и может также связывать СО, и есть центр связывания для SOI". Никакой промежуточной восстановленной формы серы не появляется, а при окислении 3 экв. NADPH освобождается сразу S2~. Это довольно медленный процесс, скорость которого составляет 6 об/с. Фермент может медленно восстанавливать нитрит, однако это не его функция; в клетке имеется другая система для осуществления этого процесса.

13.5.3. Восстановление нитрата

Различные бактерии могут образовывать АТР при переносе электронов по цепи переносчиков, оканчивающейся NO3, а не 02. Большинство анаэробов, факультативных аэробов, водорослей и растений восстанавливает NO3 до NH3 в количествах, которые необходимы для сP?нтезов аминокислот, пуринов и пиримидинов. Это осушествляется посредством последовательного действия нитрат-и нитритредуктаз.

Нитратредуктаза (мол. масса 800000)—тетрамер, составленный из двух димеров, включающих по одной субъединице с мол. массой 150 000 и по одной — с мол. массой 50 000. Фермент содержит один атом молибдена, один FAD и несколько (Fe4S4)-групп в расчете на димер. Путь электронов можно представить следующим образом:

NADPH —FAD —^-»- Fe4S4 -? Mo —!->- NOJ

и катализируемая реакция такова:

NADPH + Н+ + NOJ -»- NADP+ + NO* + Н20

Нитритредуктаза катализирует шестиэлектронное восстановление ??2 до NH3, используя NADPH в качестве восстановителя. Простетическая группа фермента из Neurospora включает FAD и сирогем. В нитритредуктазе из шпината имеется (Fe2S2)-центр. Вероятно, путь электронов здесь такой же, как и в сульфитредук-тазе. Суммарная реакция выглядит следующим образом:

3NADPH + N07 + 4Н+ -*¦ NH3 + 3NADP+ + 2Н20

502

III. МЕТАБОЛИЗМ

Железо сирогема представляет собой центр связывания для NOJ. До момента появления NH3 никакие промежуточные продукты не обнаруживаются.

Нитрогеназа — фермент, ответственный за фиксацию азота, т. е. за восстановление атмосферного азота N2 до NH3. Этот процесс осуществляется только облигатно анаэробными почвенными бактериями (Klebsiella, Clostridium), некоторыми аэробами, например Azotobacter, а также «бактероидами» Rhizobium, которые развиваются в корневой системе растений из семейства бобовых, и сине-зелеными водорослями. Около 175 млн. ? ?2 фиксируется ежегодно в мире благодаря этому процессу. Шестиэлектронное восстановление осуществляется посредством совместного функционирования двух белков. Больший компонент (мол. масса 220 000) состоит из четырех идентичных полнпептидных цепей, каждая из которых содержит (Fe4S4)-группу, и относительно небольшого полипептида, содержащего (FeS)-группу и два атома молибдена. Меньший компонент (мол. масса 55 000)—димер из идентичных субъединиц, каждая из которых содержит (Fe4S4)-группу. Последняя при восстановлении дает характерный сигнал ЭПР (g=l,94), тогда как железосерогруппы большего компонента не обладают такой способностью. В комплексе на каждый большой компонент приходится по два меньших.

Необходимые для процесса восстановительные эквиваленты поставляются от NADPH через флавопротеид к растворимому фер-редоксину. Ферредоксин восстанавливает меньший железопротеид, который в свою очередь восстанавливает железомолибдопротеид. Хотя ?? ферредокснна достаточно низок, что в принципе делает возможным восстановление атмосферного азота, для осуществления указанного процесса все же требуется АТР. Меньший железо-протеид связывает два АТР на один Fe, в результате чего ?? снижается на 100 мВ и обеспечивается возможность восстановления железомолибдопротеида. АТР гидролнзуется, только если присутствуют оба компонента сразу; на каждую пару электронов, переносимых от железопротеида к железомолибдопротеиду, гидролизуются четыре АТР.

Nj + 6Fe2+ + 6Н+ + 12ATP ->- 2NHS + 6Fe>+ + 12ADP + I2Pj

Механизм, посредством которого утилизируется АТР, неизвестен. Фермент не обладает абсолютной специфичностью к азоту; его способность восстанавливать ацетилен до этилена легла в основу разработки полезного экспериментального критерия специфичности. В отсутствие N2 или ацетилена комплекс функционирует как ???-зависимая гидрогеназа. В действительности даже в присутствии N2 ~ 7з всего потока электронов и соответственно такая же доля потребляемого АТР переправляются на образование Н2, что

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

503

и приводит к большой потере энергии. Оба компонента фермента быстро и необратимо отравляются 02. В этой связи было выдвинуто предположение, что основной функцией леггемоглобина из Rhizobium может быть связывание 02 для поддержания его эффективной концентрации ниже 0,01 мм рт. ст. Вероятно, стенка гетероцисты хорошо отделяет нитрогеназу сине-зеленых водорослей от кислорода, продуцируемого в процессе их фотосинтетической активности.

13.6. Оксидазы, оксигеназы и гидроксилазы

Хотя электронный перенос в организованной митохондриальной системе, сохраняющей энергию путем образования АТР, отвечает за большую долю использованного кислорода, имеются многочисленные ферменты, которые катализируют прямые реакции между своими субстратами и 02. Вклад таких реакций в общее потребление кислорода в организмах млекопитающих сравнительно невелик. Эти реакции могут быть включены в различные пути биосинтеза и распада, особенно в метаболизме ароматических соединений н стероидов. Очень интересный набор ферментов такого типа имеется у бактерий, как, например, в виде индуцированных ферментов у Pseudomonas; эта бактерия образует большие количества таких ферментов, когда выращивается на различных ароматических соединениях как единственном источнике углерода. Здесь представлен лишь общий обзор ферментов, относящихся к указанным категориям.

13.6.1. Флавопротеидные оксидазы

Одна категория этих оксидаз уже описана ранее; это простые самоокисляющиеся флавопротеиды, например d- и l-оксидэзы аминокислот из печени, почек и змеиных ядов (разд. 13.2). Они восстанавливают 02 до Н202, который может либо разлагаться ка-талазой, либо использоваться в реакциях, катализируемых пероксидазой (разд. 13.7.6).

13.6.2. Флавожелезопротеиды, содержащие молибден

Молибден в форме Мо6+ присутствует в активных центрах небольшого числа ферментов, которые выполняют совершенно различные физиологические функции. Весьма близки между собой ксантиндегидрогеназы печени животных и различных бактерий и грибов, ксантиноксидаза молока и альдегидоксидаза печени. Все эти ферменты представляют собой димеры с идентичными субъединицами (мол. масса 150 000), каждая из которых содержит

504

III МЕТАБОЛИЗМ

Рис. 13.16. Спектр ЭПР восстановленной альдегндоксндазы из печени кролика. Кривая регистрирует первое производное истинного сигнала. Сигналы при значениях g, равных 2,0, 1,97 и 1,94, принадлежат свободному радикалу (предположительно FADH-). Мо6+ и железосерокомплек-

су соответственно.

один Мо6+, один FAD и либо один (Fe4S4)-центр, либо два (Fe2S2)-центра. Каждая субъединица катализирует гидроксилиро-вание атома углерода в гетероциклической системе ароматических колец, например превращение гипоксантина в ксантин или ?-ме-тилникотинамида в его пиридон, и обе катализируют окисление альдегидов до соответствующих кислот. На моли