(положения от 70-го до 80-го в последовательности аминокислот), которые остаются неизменными у всех исследованных цитохромов животных и растений. Эта полоса сложена таким образом, что образует «левую сторону» гидрофобного окружения гема. Эти особенности структуры, равно как вся трехмерная структура в целом, идентичны у всех цитохромов с эукариот. Так как в обшем число аминокислотных замен во всей последовательности цитохрома с довольно постоянно для каждого нз всех исследованных видов и так как все известные в настоящее время цитохромы с эукариот эффективны в качестве субстратов для ци-тохромоксидазы из сердца лошади, представляется вероятным, что современная трехмерная структура цитохрома с возникла более миллиарда лет назад и с тех пор осталась в основном неизменной. Обработка очищенного белка смесью липидов митохондрий или очищенным фосфатидилэтаноламином приводит к образованию липидрастворимого комплекса, который на 15% может состоять из цитохрома с. В этой форме цитохром с легко взаимодействует с цитохромоксидазой в качестве ее субстрата и в этом отношении ведет себя подобно цитохрому с, находящемуся в митохондрии.

Цитохромоксидаза — конечное звено цепи — является ее единственным компонентом, который способен восстанавливать кислород. На основании спектров поглощения препаратов из дрожжей и сердечной мышцы, обработанных СО или CN и восстановленных субстратом, ранее был сделан вывод о том, что два отдельных цитохрома а и а3, вероятно, находятся в конце цепи. Считалось, что цитохром а3 способен самоокисляться при низком парциальном давлении 02 и соединяться с СО и CN~, а цитохром а — нет. Поэтому цитохром а3 рассматривался в качестве истинной оксидазы. Однако в действительности митохондрии содержат лишь один ком-

492

III. МЕТАБОЛИЗМ

понент, который можно назвать цитохромоксидазой. Это большая сложная молекула, содержащая два атома меди и две молекулы уникального гема А, показанного ниже, необычность которого состоит в том, что он содержит длинную этилфарнезильную группу, присоединенную к одному из пиррольных колец:

О ОН о он гем А

Белковый комплекс, который пересекает внутреннюю митохондриальную мембрану, имеет мол. массу ~ 200 ООО и состоит из семи различных субъединиц с мол. массой: I) 40 000, II) 33 000, III) 22 000, IV) "14 500, V) 13000, VI) 12 700, VII) 4600. Субъединицы I, II и III исключительно гидрофобны. In situ субъединнцы III, VI и VII располагаются на наружной поверхности мембраны, субъединица IV — на стороне, обращенной к матриксу, в то время как субъединнцы I и V погружены в мембрану. Показано, что субъединица III входит в центр связывания цитохрома с. Ничего не известно о центре нековалентного связывания гема или меди. 02, по-видимому, подходит к цитохромоксидазе со стороны мито-хондрнального матрикса, а это означает, что гем отделен от цитохрома с всей толщиной мембраны.

Цитохромоксидаза катализирует четырехэлектронное восстановление молекулы кислорода 02 до воды. В ходе этого процесса, вплоть до полного завершения восстановления, не обнаружено отделения каких-либо промежуточных продуктов. Такое течение процесса термодинамически оправдано, поскольку для одноэлектрон-ной стадии 02-f-e—у01 , ??=—330 мВ и для двухэлектронного

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

493

восстановления Ог+2е—>0?Г, ?'?=+310 мВ, тогда как для реакции 02+4е+4Н+—^ЩО, ?о=840 мВ. Однако посредством экспериментальных манипуляций было продемонстрировано образование как 02, так и 01'

Молекула цитохромоксидазы, очевидно, должна обладать внутренней симметрией, имея реакционный центр, к которому ферроцитохром может доставлять электроны и к которому может присоединяться 02; этот центр включает как гемы, так и атомы меди. Несмотря на то что молекула фермента, по всей вероятности, симметрична, методом ЭПР удается обнаружить только один атом гемового железа и один атом меди, что указывает на антиферро-магнитное сопряжение спинов двух других атомов. Значения Е'0 для двух атомов железа, по-видимому, существенно различаются: для атома с более высоким потенциалом, поведение которого соответствует цитохрому а3, ?о = +340 мВ, тогда как для атома железа цитохрома ? ?"? =+200 мВ. CN'-связывающий центр—либо Fe3+ цитохрома а3, либо неразличимый посредством ЭПР атом меди. Когда присоединение ферроцитохрома с происходит в отсутствие 02, электроны продвигаются, возможно через медь, к гемовому железу, восстанавливая один атом железа и один атом меди до Fe2+ и Си+ соответственно, которые можно обнаружить методом ЭПР. Химические восстановители могут восстановить весь центр, но ферроцитохром с не может легко восстанавливать вторую пару металлов. 02 связывается с Fe2+ гема с образованием промежуточного комплекса, напоминающего оксигемоглобин. Если неорганические модели процесса правомочны, второй ион металла, возможно это ассоциированный атом меди, должен связываться с другим атомом кислорода в паре

—Fe2+—О

0-CU+—

для облегчения полного восстановления кислорода и последующего отделения от иона металла в виде пары гидроксидных ионов. Однако эти подробности еще не получили полного подтверждения. В качестве возможного интермедиата привлекает внимание

fe3+_Q-

0-—Cu2+

где пероксидная группа удерживается на месте своего образования до момента введения второй пары электронов. Химически восстановленная оксидаза очень медленно восстанавливает 02. Связывание цитохрома с влияет на реакционноспособность активного центра к 02, вызывая ее увеличение. Таким образом, подлин-

494

III. МЕТАБОЛИЗМ

ный восстановитель 02 — это комплекс цитохром-с-цнтохромокси-

.даза.

е е

Напомним, что перенос электрона cyt с—>-cyt ??3—>-02 сопряжен с запасанием энергии и образованием АТР. Хотя механизм этого процесса еще неясен, при его объяснении следует учитывать тот факт, что в присутствии АТР ?? для цитохрома а3 падает более чем на 200 мВ, составляя всего около +160 мВ. Физические причины, обусловливающие те свойства, по которым различаются •а- и йз-формы, пока еще непонятны, но отметим, что суммарное значение мол. массы фермента (по сумме всех компонентов) составляет 110 000, тогда как мол. масса изолированного фермента по меньшей мере вдвое больше, а в мембране он может существовать в еще более высокополимерной форме. Это обстоятельство могло бы способствовать расположению одной из гем-купрогрупп тзблизи наружной поверхности мембраны, а другой на стороне матрикса, так что гем и медь в каждом из цитохромов а и аз должны были бы находиться в различном окружении.

Некоторые другие ферменты также могут катализировать мно-тоэлектронные восстановительные реакции без освобождения или различимого участия промежуточных продуктов. Купропротеиды церулоплазмин и лакказа прямо восстанавливают молекулярный кислород до Н20. Оба белка содержат три различных типа двухвалентной меди. Каждое из шестиэлектронных восстановлений ?2 и ??? до ??3 н SO?" до S2~ у микроорганизмов катализируется ¦одним ферментом. Это явление описывается ниже.

13.4. Бактериальные цитохромы и перенос электронов

Способ дыхания клеток высших растений, дрожжей и грибов напоминает таковой у животных клеток. Дыхание осуществляется в митохондриях, содержащих ферменты цикла лимонной кислоты, систему организованного переноса электронов с цитохромами, напоминающими цитохромы животных, и связанную с ней фосфорилирующую систему. Эффективность фосфорилирования в этих системах варьирует; например, представляется вероятным, что пункт сопряжения, связанный с первой стадией окисления NADH, может отсутствовать в дрожжевых митохондриях. Бактериальные клетки не имеют органелл, напоминающих митохондрии. Дыхательные системы бактерий, которые можно выделить из препаратов разрушенных клеток, сосредоточены в маленьких, богатых липи-ламн нерастворимых частицах разного размера, представляющих фрагменты клеточной мембраны. Эти частицы, содержащие дегидрогеназы, цитохромы и железосеропротеиды, осуществляют окислительное фосфорилирование. Дегидрогеназы в обшем случае напоминают дегидрогеназы клеток млекопитающих. Окислительное фосфорилирование в бактериях по своему характеру существенно отличается от аналогичного процесса в митохондриях млекопитающих. Ни разу •не был обнаружен дыхательный контроль; отсутствие ADP или Pi не лимитирует скорость дыхания, и бактериальные системы обычно нечувствительны к разобщающему воздействию динитрофенола. По спектрам поглощения цитохромы

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

495

бактерий классифицируются как цитохромы а, Ь и с; однако такое деление цитохромов не обязательно означает, что их взаимоотношения в процессах переноса электрона соответствуют тем, которые наблюдаются в митохондриях животных клеток. Особенно широко распространен тип цитохрома с.

Облигатные и некоторые факультативно аэробные бактерии восстанавливают 02 за счет продуктов метаболизма органических соединений; их электронпе-реносящие системы напоминают таковые в клетках эукариот. Другие бактерии используют сероводород и тиосульфат вместо органических соединений. В некоторых случаях сульфат и нитрат служат в качестве терминальных окислителей. Во всех случаях электронпереносящая цепь бактерий включает ряд цитохромов н некоторое (обычно неустановленное) число железосеропротеидов. Вообще электронпереносящне цепи бактерий удивительно разнообразны, что, однако, обусловлено вариабельностью структур компонентов одного и того же набора Ь-, с- и ?-типов цитохромов. Это будет проиллюстрировано лишь на нескольких примерах. У Micrococcus denitrificans имеется цитохром с-типа с гемом, связанным так, как у эукариот. Этот цитохром может медленно окисляться цитохромоксидазой из сердца быка, тогда как цитохромоксидаза этой бактерии может окислять цитохром с из сердца так же быстро, как и свой собственный субстрат. Известно лишь несколько других примеров такого рода.

Некоторые бактерии, по-видимому, содержат более одного аутоксидабель-ного цитохрома ?-типа, и кроме того, у бактерий широко распространен гемопротеид, который был обозначен как цитохром о. Он имеет простетическую группу, напоминающую таковую цитохром