имодействии с флавиновой дегидрогеназой, которая окисляет СоА-производные насыщенных жирных кислот до ненасыщенных (гл. 17); электронпереносящая цепь выглядит следующим образом:

2е

ацил-СоА--—*- FAD—FAD—FAD

дегидюгеназз (ЭФП) " ЭПФ-дегидрогеназа

-»- Fe4S4 -*¦ убихинон

Комплекс III — сегмент электроипереносящей цепи, где совершается восстановление цитохрома с восстановленным убихиноном. Этот комплекс включает железосеропротеид, для которого Е'о— = +280 мВ; последний, очевидно, относится к числу высокопотенциальных железосеропротеидов. Возможно, что ингибирование ан-тимицнном А объясняется его специфическим взаимодействием с этим центром.

13.3. Цитохромы

Цитохромы встречаются практически во всех аэробных организмах. В общем случае содержание цитохрома в тканях соответствует дыхательной активности. Самые высокие концентрации обнаружены в сердечной и других активно работающих мышцах, как, например, летательные мышцы птиц и насекомых. Меньшие количества присутствуют в печени, почках, мозге и в гладких мышцах. Самые низкие концентрации цитохромов наблюдаются в коже ? легких. В опухолевой и эмбриональной ткани содержание цитохромов необычайно низко; это связано с тем, что в этих тканях генерация энергии идет в основном по анаэробным путям метаболизма.

Ранние исследования цитохромов, проведенные Кейлином, показали, что в присутствии окисляемых субстратов и в отсутствие кислорода при спектроскопическом анализе суспензии ткани обнаруживается серия четко выраженных полос поглощения. Добавление кислорода приводило к исчезновению этих полос, которые заменялись группой менее интенсивных и более размытых полос. Результаты этих наблюдений позволили Кейлину установить присутствие трех цитохромов, которые он обозначил как а, Ъ и с. Каждый из них в восстановленной форме характеризовался несколькими максимумами поглощения (табл. 13.5). Из этой группы восстановленный цитохром а осуществляет восстановление молекулярного кислорода и восстанавливается цитохромом с. По мере идентификации других цитохромов каждый из них обозначался в соответствии с тем из первоначальных цитохромов, с которым у него были наиболее похожие спектроскопические показатели, напри-

32·

488

III. МЕТАБОЛИЗМ

мер bu b2, 63, 64 и т. д. Эту номенклатуру не следует рассматривать как указание на обязательное близкое родство их структур и на одинаковое значение ?? или на признак равноценности их роли в процессе электронного транспорта.

Добавление промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты в суспензию ткани в анаэробных условиях приводит к быстрому восстановлению цитохромов в последовательности Ь, С\, с и а; при введении кислорода эти компоненты быстро окисляются. Однако окисление может быть предотвращено в присутствии CN~, n3, S2- и СО. Поскольку дыхание большинства тканей животных подавляется на 90% указанными ингибиторами, то, по-видимому, заключительная стадия процесса дыхания животных клеток в норме протекает по электронной цепи, ведущей к цнтохромоксидазе.

Кроме цитохромов 65 и Р450, локализованных в эндоплазмати-ческой сети, все цитохромы животных клеток расположены в ми-тохондриальиом белок-липидном комплексе. Только цитохром с легко удается получить в форме гомогенного, водорастворимого белка путем экстракции водными растворителями; все остальные цитохромы остаются связанными с нерастворимыми митохондри-альными частицами. Однако обработка митохондрий или мито-хондриальных фрагментов детергентами, например дезоксихолатом или додецилсульфатом, позволяет выделить каждый нз мито-хондриальиых цитохромов в относительно чистой форме. Следует предупредить, однако, что свойства цитохромов в водном растворе детергента могут заметно отличаться от их свойств в привычной для них гидрофобной среде.

Цитохромы b обладают самым низким потенциалом; Ео для выделенного из сердца цитохрома b в водном растворе составляет —340 мВ, тогда как в митохондрии, судя по его поведению, Е'0 составляет около +30 мВ. Два, по-видимому, различных цитохрома b обнаружены в митохондриях, оба в комплексе III (разд. 12.4.1). Их спектральные свойства показаны в табл. 13.5. Особенно примечателен тот факт, что для цитохрома 6< ?? увеличивается от —30 до -f-245 мВ в присутствии АТР. Физиологический смысл этого явления неизвестен. Посредством экстракции детергентом удалось выделить только денатурированные формы этого цитохрома (мол. масса 28 000). Простетической группой, по-видимому, является гем (железопротопорфирин IX; разд. 12.4). Восстановленная форма не подвергается аутоокислению, а окисленная форма не реагирует с цианидом.

Цитохром С\ прочно связан в митохондриальной мембране. Его ¦ спектральные свойства напоминают свойства цитохрома с (табл. 13.5), который содержит идентичную простетическую группу, сходным способом присоединенную к белку. Цитохром Ci получен в форме агрегата с мол. массой 31 000. Содержащая двухвалентное железо форма цитохрома, а также его полимер не могут прямо

13 БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

489

Таблица 13.5 Свойства цитохромов млекопитающих

Цитохром Максимумы поглощения восстановленных форм а, нм I ?, им ?, нм ?0. мВ

Чз 600 445 +200

и 605 517 414 +340

с 550 521 416 +260

Cl 554 523 418 +225

b 563 530 430 +?0

b, 565 535, 528 430 —30(+245)

Ьь 557 527 423 4-0,0 5

реагировать с цитохромоксидазой. Добавление небольшого количества цитохрома с создает условия для быстрого окисления субстратных количеств цитохрома с\ цитохромоксидазой. Цитохромы с и Ci образуют довольно прочный комплекс, не разделяющийся при хроматографии на сефадексе. Реакция между этими двумя ци-тохромами происходит с исключительно высокой скоростью: константа скорости второго порядка для восстановления цитохрома с посредством цитохрома сх при рН 7,4 составляет 3.3· 1010 л-моль~'Х Хс^1. В митохондриальной структуре, для того чтобы вступить в реакцию с цитохромоксидазой, цитохром с должен отделиться от цитохрома с\.

Цитохромы с выделены в чистом виде из многих растений, животных и грибов и изучены более подробно, чем любой другой белок, участвующий в окислительно-восстановительных процессах.1 Полные аминокислотные последовательности известны для цитохромов с, полученных нз более, чем 70 видов. Значение этих данных обсуждается в гл. 27. Материал, излагаемый здесь, относится только к аспектам функционирования этого переносчика электронов, который в процессе электронного транспорта принимает электроны от цитохрома с\ и передает их цитохрому ?+?3. При нейт-. ральном рН ферроцитохром с не реагирует с CN", S2~ или N3. Данные многочисленных химических экспериментов, подтвержденные рентгеноструктурным анализом кристаллов ферроцитохром а с, позволяют объяснить такое отсутствие активности тем, что гемовое железо полностью скоординировано; четыре положения заполнены азотными атомами гема, одно — имидазольным азотом гистидина-18 и одно — серой метионина-80 (разд. 12.4). Поэтому внешние реагенты не имеют доступа к железу. Действительно, как показано на рис. 4.1 и 13.15, вся плоскость гема лежит в гидрофобной щели, а остатки пропионовой кислоты гема глубоко вдвинуты

490

III. .МЕТАБОЛИЗМ

Рис. 13.15. Схематическое изображение гемовой щели цитохрома с из голубого тунца (полную структуру см. на рис. 4.1). Цифрами указаны положения остатков, знаками плюс и минус — положительно и отрицательно заряженные остатки. Гл — глутамии, ? — фенилаланин, Ар — ароматический. Показаны только те остатки, ко-цорые типичны для большинства цитохромов с. [Dickerson R. ?., Timko-vich R., p. 484, in: P. D. Boyer, ed., The Enzymes, vol. XI, 3d ed., Academic Press, Inc., New York, 1975.]

в щель и образуют водородные связи с Тгр-59 и Туг-48. Только один край плоскости молекулы тема находится на поверхности молекулы и доступен для других реагентов. Узкий канал обнаруживается с каждой стороны гема, но только очень маленькие гидрофобные молекулы, вероятно, могут проходить через него. Phe-82 играет роль своего рода пробки, блокирующей вход молекул извне в гемовую щель.

Поскольку цитохром с принимает электроны от другого гемо-протеида и должен отдавать их опять-таки гемопротеиду, возникает вопрос, каким образом происходит перенос электрона при нормальных физиологических условиях. Не исключено, что в результате связывания цитохрома с с с, или с цитохромоксидазой создается возможность для возникновения контакта между краями плоскостей соответствующих гемов. Но при этом все же не получен ответ на прямой вопрос о механизме переноса электронов к Fe3+ или от Fe2+. В случае реакции цитохрома с с цитохромоксидазой рассчитана скорость квантовомеханического туннелирова-ния, причем электрон рассматривался как волновая функция; получено, что возможные значения скорости этой реакции имеют тот же порядок, что и наблюдаемая в действительности скорость. Детали связывания этих белков друг с другом остаются недостаточно понятными. Эта проблема общая для многих реакций мито-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

491

хондриального транспорта; во всех случаях белок-белковых взаимодействий с участием железосероцентров и гемопротеидов функциональные группы, изменение степени окисления которых обнаруживается спектрофотометрически или по спектрам ЭПР, погружены глубоко в молекулу белка и не могут вступать в прямой физический контакт друг с другом.

Представляется очевидным, что связывание цитохрома с с цитохромоксидазой достигается благодаря поясу катионных групп, в основном остатков лизина и аргинина, на «верхней» стороне молекулы; особое значение имеет Lys-13, находящийся как раз на вершине одного из каналов. Среди всех известных в настоящее время белков только у цитохрома с наблюдается такое обособление катионных групп; на другой стороне молекулы находится пояс анионных остатков глутамата и аспартата, которые могут иметь отношение к связыванию цитохрома с с редуктазой (цито-хромом С\) или вообще к положению фермента в электронперено-сящей цепи. Совершенно особое место принадлежит группе из 11 остатков