отинамид-мононуклеотидом при расщеплении пирофосфатной связи NAD+ под действием ДНК-лигазы (гл. 25). Некоторые ферменты, очевидно, являются различными формами обычной NAD+нуклеозида-зы (гл. 24), которая гидролизует ?-рибозильную связь NAD+ с освобождением никотинамида и аденозилпирофосфорилрибозы (ARPPR):

н2о

NAD -J- ? ?—*- никотинамид + ?—ARPPR < > ? -f ARPPR

Эта гидролитическая реакция ингибируется никотинамидом, механизм действия которого таков, что в присутствии больших концентраций никотинамида первая стадия реакции обращается. Для фермента нз ядер клеток печени Кг=250 мкмоль/л. Дифтерийный токсин сходным образом расщепляет NAD+, но переносит остаток ARPPR к необходимому для синтеза белка фактору-2 элонгации (EF-2), в результате чего весь процесс ингибируется (гл. 26). Клеточное ядро содержит еще одну NAD+HyMeo3Hfla3y, которая, однако, переносит ARPPR к рибозе второй молекулы ARPPR с образованием полиаденозиндифосфорибозы— полимера с неизвестной

472

III. МЕТАБОЛИЗМ

функцией. Эта NADa3a даже более легко ингибируется никотин-амидом (/(NAD = 25o мкмоль/л, /СгнпкотинамиД = о15 мкмоль/л). Заме-

тнм, что уроканаза (гл. 23) из бактериальных источников содержит прочно связанный NAD+ в качестве скорее структурного, чем функционального элемента.

13.2. Флавопротеиды

В 1932 г. Варбург и Христиан получили из дрожжей «желтый фермент», способный катализировать окисление NADPH. Вскоре после выяснения структуры рибофлавина было установлено, что простетическая группа этого фермента — рибофлавин-5'-фосфат (флавиимононуклеотид, FMN). Позднее было обнаружено, что коферментом почечной оксидазы D-аминокислот является флавинадениндинуклеотид (FAD) (разд. 12.1.1). Флавопротеиды распространены повсеместно. Способ присоединения флавинового нуклеотида к ферментам может быть различным; благодаря дополнительному связыванию одного или более ионов металла, железосерокомплекса или гема, возникает необычное разнообразие окислительно-восстановительных ферментов.

Связь флавиннуклеотидов с апобелками значительно прочнее, чем связь пиридиннуклеотндов с их дегидрогеназамн. Константа равновесия для диссоциации комплекса белок-флавин^*белок+ +флавин обычно имеет порядок 10~8—10~9, поэтому фактически флавиновый компонент остается постоянно связанным с апофер-ментом. В некоторых случаях ковалентная связь соединяет FAD с остатком полипептидной цепи белка, и поэтому после протеолиза FAD остается все еще связанным с определенной аминокислотой. В дегидрогеназе ь-гулонолактона из печени и в бактериальных дегидрогеназах тиамина эта связь находится между 8а-положени-ем рибофлавина флавинмононуклеотида FMN и N-1 гистидина белка. В сукцинатдегидрогеназе и оксидазе D-6-оксиникотина подобная связь имеется между FAD и гнстидином. Цистеиновый остаток моноаминоксидазы из митохондрий печени присоединен в 8сс-положении рибофлавина тиоэфирной связью, в то время как между рибофлавином н цитохромом с552 образуется тнополуаце-таль. В большинстве других случаев флавиннуклеотид может быть отделен от белка при обработке высококонцентрированными солевыми растворами при рН 2—4.

Из табл. 13.3 следует, что флавопротеиды удивительно разнообразны (мол. масса 12 ООО — 700000). Они могут состоять из одной полипептидной цепи с одним флавиннуклеотидом или из нескольких субъединиц, с которыми связаны не только несколько флави-новых компонентов, но также один или более металлов, железо-сероцентров или гемов, что означает совмещение миниатюрной

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

473

Таблица 13.3

Некоторые флавопротеиды3

Физиологический акцептор электронов Другие функциональные компоненты

Субстрат Флавии Источник

D -Аминокислоты о2 FAD Печень, почки

L -Аминокислоты о2 FAD или FMN Почки, змеиный яд

Моноамины о2 FAD Печень, почки, мозг

Диамины о2 FAD То же

Глюкоза о2 FAD Печень, плесневые грибы

а-Оксикислоты о2 FMN Почки

Ацил-СоА (Сб — Cl2) ЭПФ FAD Митохондрии

Бутирил-СоА ЭПФ FAD »

Н2 (фотосинтез) NADP-редук-таза FMN Анаэробы, сине-зеленые водоросли

Днгпдролипоат NAD+ Внутренний дисульфид Митохондрии, Е. coli

NADPH Глутатион FAD Внутренний дисульфид Печень, дрожжи, Е. coli

NADPH Тиоредоксин FAD Внутренний дисульфид Печень, Е. coli

NADH Н2Оа FAD Внутренний дисульфид Streptococcus fae-calis

NADH Цитохром Ьъ FAD Микросомы печени

NADPH Цитохром Р460 F.AD+FMN Микросомы печени, Pseudomonas putida

D -Лактат Цитохром с FAD Zn2+ Дрожжи

Ферредоксин NADP+ FAD Хлоропласты

NADPH Адренодок-син FAD ?Лтохондрии коры надпочечников

Дигидрооро гат NAD+ FAD+FMN (FeS)„ Zymobacterium ото-ticum

NADH Убихинон FMN (FeS)„ Митохондрии

Сукцинат » FAD (FeS)„ »

Восстановленный ЭПФ » FAD (FeS)„ »

Холин » FAD (FeS)„ »

474 ш- МЕТАБОЛИЗМ

Продолжение табл. 13.3

Субстрат Физиологический акцептор элелтронов Флавии Другие функциональные компоненты Источник

а-Глнцерофосфат Убихинон FAD (FeS)n Митохондрии

Саркозин » FAD (FeS)n »

Пурины FAD Mo, (FeS)4 Молоко

Пурины NAD+ FAD Mo, (FeS)4 Печень

Альдегиды о2 FAD Mo, (FeS)4 Печень

NADPH N07 FAD Сирогем Neurospora crassa

NADPH sor FAD-fFMH (FeS)4, сирогем ?. coli

L -Лактат Цитохром с FAD Гем Дрожжи

a ЭПФ — ^лектроипереносящнн флавопротеид; (FeS)n—железосероцентр; о сирогеме см. разд. 13.5.2.

электронпереносящей системы на одном белке. Несколько примеров, иллюстрирующих разнообразие флавопротеидов, приведено в табл. 13.3.

Спектр поглощения флавопротеидов имеет максимумы ~280, 350—380 и 450 нм. Двухэлектронное восстановление флавина приводит к почти полному исчезновению полосы при 450 нм и частичному уменьшению поглощения при 280 и 380 нм. Три кольца рибофлавина в его окисленной форме расположены в одной плоскости. Восстановленная форма принимает конфигурацию крыла бабочки с осью перегиба между N-5 и N-10. Частичное восстановление флавопротеида до его семихинона может быть достигнуто путем титрования дитионитом или естественным субстратом в анаэробных условиях. Семихиноидная форма фермента, как правило, дает сигнал электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) при g=2, характерный для органических свободных радикалов. Отсутствие сигналов ЭПР у некоторых частично восстановленных форм флавопротеидов, несмотря на сходство спектральных характеристик таких форм с приведенными на рис. 13.9, позволяет предположить, что пара флавиновых семихинонов вступает в спин-спиновое взаимодействие. Различают два класса флавопротеидов: те, которые образуют при частичном восстановлении красный семихинон, и те, которые образуют синий семихинон (рис. 13.10). К первой группе относятся главным образом оксидазы; это означает, что полностью восстановленная форма окисляется 02 с образованием Н202. Вторая группа представлена дегидрогеназамн; они взаимодействуют с 02 гораздо медленнее по одноэлектронной реакции, которая идет

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

475

18 000

анионная форма семихинона

окисленная форм?

400

500

Длина в^ччы, нм

нейтральный семихинон

600

70(

Рис. 13.9. Спектры поглощения двух форм флавииового семихииона в присутствии глюкозооксидазы. Красная анионная форма получена при освещении видимым светом в анаэробиозе в присутствии этилендиамннтетраацетата при рН 9,2. Синяя форма получена в результате снижения рН до 5,85. [Massey V., Mathews R. G., Fonst G. P., Howell L. G., Williams С. H., Jr., Zanetti G., Ronchi S., p. 384, in: H. Sund, ed.. Pyridine Nucleotide Dehydrogenases, 5th ed., Springer-Verlag, New York, Inc., New York, 1970.]

с образованием устойчивого синего семихинона и аниона супероксида Of.

Свободный рибофлавин обладает сильной флуоресценцией с максимумом ~500 нм. FM.N флуоресцирует с такой же интенсивностью, тогда как флуоресценция FAD составляет лишь 10% таковой для рибофлавина; это, возможно, объясняется внутренним поглощением, обусловленным адениновой частью молекулы FAD, хотя с такой точкой зрения не согласуются данные о том, что в растворе две кольцевые системы молекулы FAD расположены ортогонально относительно друг друга. В общем случае флавиновые компоненты флавопротеидов также обнаруживают очень слабую флуоресценцию. Исключением является дигидролипоилдегидроге-наза, флуоресценция которой почти равна флуоресценции свободного FMN, что служит указанием на разворачивание динуклеотид-ной структуры. Е'о для флавопротеидов варьирует в широких пределах, причем на окислительно-восстановительный потенциал заметно влияет способ связывания кофермента с апобелком.

Вероятно, самые простые из флавопротеидов — это оксидазы, каждая нз которых состоит только из белка и флавиннуклеотида.

476

III. МЕТАБОЛИЗМ

В некоторых случаях флавиновый остаток принимает пару водородных атомов и восстановленная форма спонтанно восстанавливает 02 до Н202. Однако иногда субстрат отдает флавину только один электрон, и тогда флавин осциллирует между окисленной и восстановленной семихинонной формами:

о2

МН2 + ?—FAD

?—FADH—??·

?—FAD + M + ?202

Любопытно, что оксидаза ь-аминокислот из печени содержит две молекулы FAD на молекулу фермента, тогда как фермент почек — две молекулы FMN. Реакции такого типа — главный источник пер-оксида водорода в метаболических системах. Пероксид водорода используется в качестве окислителя несколькими пероксидазами (разд. 13.7.6), но большая часть образованного перокснда разрушается каталазой до Н20 и 02 (разд. 13.7.6).

9егиЗрогеназы ?,?,.? 0

N *>

О

необязательный FI,красный обязательный 5-HFI, голубой

рабикалы

0С

N ?

?': белок I

? ?

ООН

пероксиЭ

гетеролитическое расщепление

[белок

СН-

СН

-о1 "

н+ + ?2· *-

супероксиЭ

гемолитическое расщепление

I А

•?^?^? ,??

персхооныи

V° "H2F|-°2; ??'

JNH комплекс" Ь>км^

HqO

,. е>: 'ОН I белок!

-FI-9a-OOH V->-Г, ' 5-HF(-4a-OOH

N111 влокированный^^^^ " ^