Митохондрии сердца А

Фарнезилпнрофосфат NADP Печень В

Галактоза NAD Pseudomonas flurescens В

Глюкоза NAD Печень В

Глюкозо-6-фосфат NADP Дрожжи в

Глутамат NADP, NAD Печень в

Глутатион NADP Дрожжи в

За-Оксистероиды NAD Печень в

Зр-Оксистероиды NAD Pseudomonas в

17р-Окснстероиды NAD, NADP Печень в

6-Фосфоглюконат NADP » в

3 - Фосфогл ицер альдегид NAD Дрожжи, мышца в

NADP+ NAD Pseudomonas, ?. coli в

Таким образом, стереоспецифичность переноса водорода определяется тем, к какой стороне плоскости никотинамидного кольца обращен связанный с ферментом субстрат.

Никотинамиднуклеотиды служат в качестве коферментов для более 250 различных дегидрогеназ, некоторые из которых перечислены в табл. 13.2. Между химическими свойствами субстрата и избирательностью фермента по отношению к NADP+ или NAD+ не наблюдается взаимосвязи. Многие дегидрогеназы обнаруживают активность только с одним из этих нуклеотидов, несколько дегидрогеназ с почти равной скоростью катализирует реакцию с любым нуклеотидом, но большинство дегидрогеназ проявляет каталитическую активность с одним коферментом, причем скорость таких реакций во много раз превышает скорость реакций с другим нуклеотидом. Поведение фермента по отношению к коферменту может меняться в зависимости от источника, из которого этот фермент получен. Так, митохондриальные глутаматдегидрогеназы печени могут использовать как NAD+, так и NADP+. Когда дрожжи или клетки Neupospora выращиваются в среде, содержащей глу-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

461

Таблица 13.2

Некоторые дегидрогеназы, использующие пиридиннуклеотиды в качестве коферментов

Субстрат

Продукты

Кофермент

Источник

Ациклические поли- Кетозы NAD Печень крысы, Aero-

спирты bacter

Альдегиды Карбоновые кислоты NAD Печень

?-Полуальдегид аспа- ?-Аспартилфосфат NAD Печень

рагиновой кислоты

Бетаинальдегид Бетаин NAD Печень крысы

Этанол Ацетальдегид NAD Печень, дрожжи, почки

D-Глицерат Оксипируват NAD Печень

?-Глицерофосфат Диоксиацетонфосфат NAD Дрожжи, мышца, печень

L-Гулонат Ксилулоза + СОг NAD Почки

?-Оксикислоты ? - Альдегидокислоты NAD Печень

D (—)Р-Оксибутират Ацетоацетат NAD Печень

L (—)-р-Окснбути- Ацетоацетил-СоА NAD Печень

рил-СоА

Зр-Оксистеронды З-Кетостероиды NAD Pseudomonas

17р-Оксистероиды 17-Кетостероиды NAD »

Инозинат Ксантилат NAD ?. coli Aerobacter aerogenes

Изоцитрат ?-Кетоглутарат + С02 NAD Митохондрии сердца быка, печени крысы и дрожжевые

Изоцитрат а-Кетоглутарат+СОг NADP Цитозоль сердца

Лактат Пируват NAD Мышца, другие животные ткани

Малат Оксалоацетат NAD То же

Малат Пируват+С02 NADP Цитозоль печени голубя

Полуальдегид малоно Малонат NAD Pseudomonas

вой кислоты

D-Маннит D-фруктоза NAD Acetobacter

Глицер альдегид-3- 1,3-Дифосфоглицерат NAD Все животные ткани,

фосфат дрожжи, бактерии

Рибнт Рибулоза NAD Печень

Полуальдегид янтар - Сукцинат NAD Мозг, бактерии

ион кислоты

462

III. .МЕТАБОЛИЗМ

Продолжение табл. 13.2

Субстрат

Продукты

Кофермент

Источник

Полуальдегнд тар-троновой кислоты

Глицерин

Глутамат

ЗР-Оксистероиды

Дигидрофолат

D-Фруктоза

Глюкозо-6-фосфат

L-Гулонат Изоцитрат

Глнцерат

Диоксиацетон

?-Кетоглутарат + +NH4

З-Кетостероиды

Тетрагидрофолат

5- Кето- D-фруктоза

6- Фосфоглюконат

Пнруват+С02

Малат

Восстановленный глу- Глутатион татион (GSH) (G—SS—G)

Шикнмат Дегидрошикимат

NAD

NAD или NADP

NAD или

NADP

NAD или NADP

NADP

NADP

NADP

D-Глюкуронат NADP а-Кетоглутарат+ C02 NADP

NADP NADP

NADP

Pseudomonas

Печень свиньи, крысы, ?. coli

Мышца, печень

Печень

Gluconobacter cirinus

Печень, эритроциты, дрожжи

Почки

Различные животные ткани, дрожжи

Сердце

Дрожжи, печень Фасоль, Е. coli

тамат, их глутаматдегндрогеназы специфичны к NAD+; если же в среде отсутствует эта аминокислота, продуцируется NADP+-3a-висимый фермент. Опять-таки глкжозо-6-фосфат — дегидрогеназа дрожжей абсолютно специфична к NADP+, в то время как этот же фермент из печени млекопитающих использует NAD+ со скоростью, составляющей ~7% скорости использования NADP+ при эквивалентных концентрациях этих коферментов. Такое различие в специфичности к NAD+ и NADP+ позволяет клетке поддерживать NAD+ главным образом в окисленном, a NADP+ — в почти полиостью восстановленном состоянии в соответствии с их функциями. В тканях животных концентрация NAD+ варьирует от 0,5 до 3,0 ммоль/л, тогда как концентрация NADP+ — от 0,01 до 0,1 ммоль/л; только в печени концентрация NADP+ составляет '/3 концентрации NAD+. Эти концентрации имеют тот же порядок, что и Km реакций с участием указанных веществ, когда они выполняют роль катализаторов. В общем случае ферменты, ответственные за окислительные процессы, снабжающие энергией организм, нуждаются в NAD+, тогда как ферменты, катализирующие реакции восстановительных синтезов, используют NADPH. Единство глав-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

463

ных путей метаболизма в организмах различных видов находит свое отражение в почти универсальном распространении тех многочисленных NAD+- или NADP+-3aBHCHMbix дегидрогеназ, которые имеются в живых формах.

Когда специфичный к NAD+ фермент присутствует в одном клеточном отсеке, а специфичный к NADP+ фермент — в другом, челночное движение субстрата туда и обратно через мембрану может служить в качестве механизма переноса восстановительных эквивалентов. Например, две изоцнтратдегидрогеназы (табл. 13.2) —NAD+-3aBHCHMaH в митохондриях (индекс „мит") и ЫАОР+-зависимая в цитозоле (индекс „цит") — могут функционировать следующим образом:

?-кетоглутарат -f- С02 + NADHMUT -f- Н+ g >¦ изоцитрат -f- NAD+,T изоцитрат -f- NADP+T 4=fc ?-кетоглутарат -f C02 -f- NADPH4HT + H+ NADHHht + H+ + NADP+T =г=ь NAD+T + NADPH4„T + H+

Таким образом, способный к диффузии изоцитрат переносит водород через митохондриальную мембрану, между NAD+ и NADP+.

«Водород» могут также переносить другие пары ферментов, имеющие общий субстрат. Малатдегидрогеназа и малик-фермент катализируют следующую пару реакций:

малатдегндгогеназа +

оксалогцетатмит -f- NADHMHT -f Н+ ~ *" малат^,,,. -f- NADmht

малик-фермент

[малатцит + N<\DP+T с 3 пируват + NADPH4HT + Н+ + С02 оксалоацетат -f- NADHMHT + NADP+T -> пируват + С02 + NADmht + NAPH4HT

В этом случае малат пересекает митохондриальную мембрану, перенося водород митохондриального NADH к NADP+ цитозоля. Такой перенос водорода через митохондриальную мембрану является важным аспектом превращения углеводов пищи в резервные жирные кислоты (гл. 17).

Термины простетическая группа и кофермент не совсем подходят для обозначения никотинамиднуклеотидов. Значения Km для NAD+ и NADP+ варьируют от 100 до 1 мкмоль/л, что лишь незначительно ниже Km для «субстратов» этих ферментов (1—0,01 ммоль/л). В общем случае NADH связывается с большинством дегидрогеназ в 10—100 раз прочнее, чем NAD+. Никотинамиднук-леотиды легко диссоциируют от дегидрогеназ и, по существу, представляют собой косубстраты, коферментная функция которых

464

III. МЕТАБОЛИЗМ

заключается лишь в том, что в физиологических условиях восстановленные формы окисляются другими ферментами, катализирующими этот процесс; в результате создаются условия для повторного использования нуклеотидов, так что они могут циклически функционировать в каталитических количествах. Кроме того, благодаря такой легкости диссоциации никотинамиднуклеотиды, единственные среди окислительных коферментов, могут принимать участие в дисмутациях, т. е. в восстановлении одного метаболита другим:

Для подобного сопряжения требуется челночное перемещение NAD+ между поверхностями двух субстратспецифичных дегидрогеназ. В качестве наиболее показательных примеров такого процесса можно привести участие NAD+ в гликолизе (разд. 14.4) и восстановительный синтез жирных кислот с использованием NADPH, который генерируется при окислении углевода (разд. 14.8). Интересная возможность открывается при сопряжении пары дегидрогеназ, относящихся соответственно к А- и В-типу. Например, представляется вероятным, что в процессе гликолиза NADH, восстановленный на поверхности глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназы, может быть использован для восстановления пирувата лактатдегидрогеназой без отделения от первого фермента. Примечательна в этом отношении лактат-малат — трансгидрогеназа из Micrococcus lactilyticus, связывающая NAD+ так прочно, что он может быть удален только посредством обработки 4 ? мочевиной. NAD+ остается прикрепленным к ферменту, который способен акцептировать лактат и оксалоацетат или пируват и малат на своих субстратсвязываюших центрах.

В противоположность своим окисленным формам NADH и NADPH сильно поглощают при 340 нм. Это свойство лежит в основе большей части аналитических методов наблюдения за ходом реакций, в которых участвуют эти коферменты. Кроме того, при активации светом при 340 нм оба кофермента обнаруживают флуоресценцию. Максимальное излучение наблюдается при ~465 нм. Связывание NADH или NADPH с апоферментом дегидрогеназы обычно сопровождается сдвигом максимума поглощения в более коротковолновую область (330—335 нм) и аналогичным сдвигом максимума флуоресценции до ~440 нм. В растворе изолированного кофермента большая доля флуоресцентного излучения от восстановленной никотинамидной части молекулы поглощается (гасится) соседним аденином, что объясняется сложенной структурой молекулы динуклеотида. Растянутая структура связан-

АН2 + NAD+ — В + NADH -f H+

A + NADH-f H+ BH2 + NAD+

АН2 + В

A -f- ВНа

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

465

ного с белком динуклеотида обусловливает значительную интенсификацию излучения (увеличение квантового выхода), вследствие чего измерение флуоресценции — особенно чувствительный метод для обнаружения комплекса между ферментом