ающим фактором Fi, участие которого требуется для синтеза АТР. Этот холодолабильный комплекс с молекулярной массой 340000 содержит пять типов полипептидных цепей (от каждого по две), обозначаемых как ?, ?, у, 6 и ?, с молекулярными массами 56 000,. 52 000, 32 000, 21000 и 11 500 соответственно. На основании поведения фермента при диссоциации предполагается следующее расположение субъединиц:

(?) (F)

а,у,е «,?,?

? ?

Ни одна из отдельных субъединиц не обнаруживает АТРазную активность, но эту активность можно наблюдать при комбинации субъединиц ? и ?. Изолированный фермент содержит две прочно связанные молекулы ADP на молекулу фермента. Они могут быть удалены с помощью нескольких процедур, включая кратковременную обработку трипсином; процедуры не затрагивают гидролитической активности АТРазы, но вызывают утрату АТРсинтетазной активности. Отсюда следует, что та форма F|, которая содержит связанный ADP, и есть активная форма фермента в мембране. Судя по нескольким критериям, этот белок претерпевает значительное конформационное изменение при активации мембраны потоком электронов.

Мембрана митохондрий также содержит F0 — гидрофобную субструктуру, состоящую по крайней мере из четырех полипептидных цепей. Полученный из аналогичной по функции мембраны Е. coll Fo относится к числу самых неполярных белков, известных в настоящее время; он не содержит триптофана, цистеина, серина и гистидина, но обогащен метионином, глицином, лейцином и ала-нином. Встраивание F0 в липиды мембраны объясняется его гидрофобной природой. Считается, что F2 специфически прикреплен к Fo ?-цепями. Удаление Fi из мембраны делает F0 «проницаемым» для внешних протонов. Просачивание протонов, по-видимому, происходит по «каналу», имеющемуся в F0: этот канал может быть, «запечатан» либо путем повторной добавки Fi, либо под действием днциклогексилкарбодинмида (ДЦКД, разд. 12.5.1), который ковалентно реагирует с F0. Очевидно, простирающийся через толщу мембраны F0 и представляет собой тот канал, через который протоны переходят к активному центру АТРсинтетазы. Вполне возможно, что эффективная [Н+] в этом протонном канале может

448

III. МЕТАБОЛИЗМ

быть значительно выше, чем в растворе на любой стороне мембраны, создавая на активном центре микросреду, которая управляет образованием АТР. Детальный механизм, посредством которого осуществляется это управление, неизвестен. Результаты наблюдений дают основание предполагать, что фермент действует по типу «перескока» («флип-флоп») с использованием двух площадок связывания субстрата. АТР связана с одной из них, а вторая связывает ADP и Р,-. Изменение ферментного белка, индуцированное по крайней мере двумя протонами на молекулу, вызывает одновременное образование АТР на одной площадке и высвобождение АТР на другой и т. д. Не ясно, является ли это изменение только кон-формационным или также включает образование промежуточного фермент-фосфатного комплекса.

Уверенность в правильности протондвижущей гипотезы основана большей частью на результатах опытов с модельными системами. С этой целью можно приготовить пузырьки из митохондриаль-ных фосфоглицеридов или из фосфоглицеридов соевых бобов, в которые встроены F[ или F] + F0, а также, например, цитохромокси-даза, цитохром с и его восстановитель, такой, как аскорбиновая кислота. Препараты такого типа выделяют протоны при окислении субстрата и в присутствии ADP и Р* участвуют в синтезе АТР, тогда как в обычном растворе этих белков и субстратов АТР не может образовываться.

Вывернутые субмитохондриальные частицы (разд. 12.3.1) при окислении сукцината или NADH выделяют протоны в свое внутреннее пространство. Если смоделированные пузырьки приготовлены таким образом, чтобы ориентация их мембраны соответствовала ориентации мембраны вывернутых субмитохондриальных частиц с АТРазой на наружной поверхности, то тогда внутри таких пузырьков происходит закисление, как, например, при встраивании функционирующего комплекса III, это сопровождается синтезом АТР на наружной поверхности. Особенно впечатляющим оказался результат встраивания в смоделированные пузырьки полученного из пурпурной мембраны бактерии Halobacterium halobium бактериородопсина — соединения сходного с родопсином сетчатки (гл. 40). При освещении эта структура «перекачивает» протоны из среды внутрь пузырька. Когда включали в пузырьки АТРазу митохондрий печени таким образом, чтобы сферические головки были на наружной стороне пузырьков, при освещении наблюдался синтез АТР.

В описанных выше модельных системах с вывернутыми пузырьками, а также в хлоропластах при процессе фотосинтеза (гл. 16) трансмембранный градиент кислотности ??? — основная движущая сила синтеза АТР. Но в митохондриях in situ и в дышащих бактериях (см. ниже) наблюдаемый ???, составляющий лишь немногим больше 1, слишком мал, чтобы отвечать за синтез АТР.

12 БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

449

Как отмечалось ранее, при обычных физиологических условиях для синтеза АТР требуется Д?«250 мВ. При переводе ??? в электрические единицы, получаем

Таким образом, если ???^?, то трансмембранный потенциал составляет лишь 60 мВ, что недостаточно для осуществления синтеза АТР, даже если [ADP] и [Рг] были бы очень высокими, а [АТР] очень низкой. Однако в работающей митохондрии разность электрических потенциалов поперек мембраны ?? близка к 175 мВ. Суммарный эффективный электрохимический потенциал выражается просто как

Измерения показали, что электрохимический потенциал в митохондриях и бактериальных мембранах ???+ составляет от 230 до 250 мВ, т. е. достаточен для осуществления синтеза АТР. При использовании специальных методик можно получить из липидов соевых бобов или из фосфатидилэтаноламина или фосфатидилсери-на (но не из фосфатидилхолина) плоские мембраны, в которых соответствующим образом ориентирована цитохромоксидаза; в таких мембранах выброс протонов происходит только на той стороне, на которой расположен цитохром с, и ?? может быть прямо измерено подходящими электродами. У таких «грубых» препаратов обнаруживали ??«200 мВ. Подобные наблюдения сделаны и с встроенным в плоскую мембрану бактериородопсином при освещении.

12.5.5.2. Разобщители

Механизм действия многих классических разобщителей окислительного фосфорилирования может быть объяснен с позиций протон-движущей гипотезы. В присутствии разобщителей синтез АТР не происходит, тогда как скорость окисления субстрата и потребления кислорода максимальны. Примеры таких соединений — 2,4-динитрофенол и л-трифторметоксикарбонилцианндфенилгидразон:

?? =-?-· ??? = —60??? (мВ) при 30°С

???+ = ?? — 60??? (мВ)

ОН

?02

3,4- Йинитрофенол

трифторметокси гсврбонил _ иианийфенилгиЭрааон

29—1143

450

III. МЕТАБОЛИЗМ

Эти соединения представляют собой липофильные слабые кислоты, которые могут мигрировать через липидную фазу мембраны как в ионизированной, так и в неионизированной форме. При этом они замыкают протонный ток, переправляя протоны непосредственно через липидную фазу мембраны.

Существуют также истинные ингибиторы окислительного фосфорилирования, из числа которых особенно примечательны ДЦКД и антибиотик олигомицин. Как отмечалось ранее (разд. 12.5.1), ДЦКД реагирует с F0, блокируя перемещение протонов через мембрану. Олигомицин каким-то подобным образом реагирует с «ножкой», связывающей Fi с мембраной, так что становится невозможным как синтез АТР, так и перемещение протонов. Торможение потока протонов сопровождается таким сдвигом равновесия реакций между протонсекретирующими компонентами электронперено-сящей цепи, в условиях которого вообще не могут осуществляться ни синтез АТР, ни движение потока электронов (дыхание).

12.5.5.3. Обратимость

Ранее отмечалось, что в митохондрии при анаэробиозе и наличии АТР может происходить восстановление NAD+ сукцинатом. Это становится возможным благодаря обратимости действия АТРазы. Генерируемые при гидролизе матриксной АТР протоны продвигаются через F0 обратно в межмембранное пространство, причем создается [Н+]; в межмембранной жидкости. Это явление было изучено в опытах с обычными вывернутыми пузырьками, когда оказалось, что направление потока Н+ через мембрану с той стороны, где идет гидролиз АТР, определяется расположением АТРазы в каждом из двух изученных препаратов. Если представить упрощенно, что NADH-дегидрогеназа (комплекс I) катализирует реакцию

H+ + NADH-

2е (к флавопротеиду) NAD+

2Н+ (на наружную сторону мембраны)

то сукцинатдегидрогеназа должна отдавать 2е в электронперено-сящую цепь (?о = +30 мВ), в то время как АТРаза развивает сильное локальное давление протонов на мембране. Поскольку NAD+ действительно восстанавливается, протонное давление, возникающее при гидролизе АТР в таких экспериментальных условиях, должно иметь величину почти 300 мВ.

Это обстоятельство прекрасно раскрывает природу того «сцепления», которое сопрягает окисление с фосфорилированием. Дыхание не может осуществляться, если не имеются в наличии ADP

12. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

451

и Р{, которые, комбинируясь, дают АТР. Если АТР в матриксе имеется в избытке, a ADP и Pi недоступны, обратимая АТРаза обеспечивает максимальное протонное давление в межмембранном пространстве. Окислительный процесс в этом случае не может протекать, так как окислительно-восстановительный цикл каждого из работающих комплексов обязательно сопровождается также и «секрецией» протонов. Если последняя становится невозможной из-за уже существующей высокой [Н+], созданной АТРазой активностью, перенос электронов также невозможен. Таким образом, механизм сцепления в действительности заключается в установлении определенного протонного давления на наружной стороне внутренней мембраы.

Еще один компонент мембраны — NADP-NAD-трансгидрогена-за; она напоминает АТРазу в том отношении, что состоит из крупного водорастворимого белка, связанного с белковым комплексом, который является интегральной частью мембраны. Эта трансгид-рогеназа катализирует митохондриальную реакцию

NADH + NADP+--* NAD+ + NADPH

Можно предположить, что процесс также совершается с участием механизм