частвует NAD+:

ноос ноос ?

нсн с

FAD + НСН =± С +FADH2

СООН нх чсоон

янтарная кислота срурмаровая кислота

Сукцннатдегидрогеназа, полученная из сердечной мышцы (мол. масса 97 000), представляет собой интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Фермент состоит из двух субъединиц с мол. массой 70 000 и 27 000. Более крупный компонент имеет субст-ратсвязывающий центр, а также содержит FAD, который ковалентно связан с гистидиновым остатком фермента:

N^^N—СН.

н2сЗ^Х

К1—HN—С—?

с=о

R1

R1 - белковый остаток фермента R5-остаток молекулы FAE

Кроме того, обе субъединицы содержат негеминовое железо, напоминая в этом отношении некоторые белки электронпередаю-щих систем митохондрий, хлоропластов, пузырьков плазматической мембраны бактерий, мембран эидоплазматической сети, а также относительно небольшую "руппу растворимых ферментов. В большинстве случаев эта структурная группировка обусловливает характерное поглощение в видимой области спектра, а в восстановленной форме дает отчетливый спектр электронного парамагнитного резонанса (g=l,94). При наиболее распространенной структуре (FeS)2 (две группы этого типа входят в состав субъединицы сукцинатдегидрогеназы с мол. массой 70 000) хромофор негеминового железа состоит из пары атомов железа, расположенных друг к другу достаточно близко для того, чтобы делить между собой единственный электрон или вступать в антиферромаг-

410

III. МЕТАБОЛИЗМ

нитное сопряжение. Кажущаяся наиболее разумной структура хромофора негеминового железа показана ниже (рис. 13.14).

Окислительно-восстановительный потенциал этой группы определяется белком, в котором она находится. ?? групп на большой субъединице оцениваются значениями 240 и 30 мВ соответственно. Е'а пары сукцинат/фумарат составляет около +30 мВ. На малой субъединице находится еще один ансамбль негеминового железа, соответствующий типу, обозначаемому (FeS)4 (?о~120 мВ). Электроны движутся от субстрата к флавину и через группы негеминового железа на большой субъединице к негеминовому железу на малой субъединице. Хотя можно было бы рассматривать только большую субъединицу как собственно сукцинатдегидроге-назу, эти две субъединицы тесно связаны друг с другом в структуре митохондриальной мембраны.

Продукт реакции находится в транс-форме; цис-изомер — ма-леиновая кислота не образуется этим ферментом. Малонат—специфический конкурентный ингибитор. В достаточно высоких концентрациях малонат может применяться для прерывания цикла лимонной кислоты; в результате происходит накопление сукцината.

Оксалоацетат, конечный продукт цикла, в низких концентрациях— мощный ингибитор сукцинатдегидрогеназы. Ингибирован-ный фермент со связанным с ним оксалоацетатом становится неактивным, т. е. каталитически инертным, если только оксалоацетат не диссоциирует. Перейдя в неактивную форму (природа молекулярного изменения неизвестна), фермент вновь приобретает активность только при действии специфических активаторов, особенно АТР и восстановленной формы убихинона (разд. 12.4.1), который в митохондрии играет роль непосредственного акцептора электронов от сукцинатдегидрогеназного комплекса.

12.2.2.6. Образование малата

Обратимая гидратация фумарата с образованием l-малата катализируется фумаразой — тетрамером из четырех идентичных полипептидных цепей (мол. масса каждой 48 500):

Н20 + НООС—С—? -?—>¦ НООС—СН2

II I Н—С—СООН НО—С—СООН

фумаровая кислота j!^

L-яблочная кислота

Для реакции в том виде, как она записана, /С=4, и, следовательно, она легко обратима. Примечательна абсолютная стерическая специфичность в отношении транс-присоединения ? и ОН по двойной связи фумарата и к образованию только l -оксикислоты.

12. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

411

12.2.2.7. Регенерация оксалоацетата

Малат окисляется в присутствии малатдегидрогеназы и с образованием оксалоацетата:

Фермент (мол. масса 66 000) состоит из двух субъединиц, для которых известны две формы, так что в митохондриях печени крысы были обнаружены три изофермента. В центре связывания NAD+ присутствует сульфгидрильная группа. Этой реакцией цикл полностью завершается, и образующийся оксалоацетат становится доступным для конденсации со следующей молекулой ацетил-СоА для повторения процесса. Однако в состоянии равновесия направление процесса сдвинуто в сторону обратной реакции — восстановления оксалоацетата под действием NADH. Хотя это обстоятельство позволяет избежать накопления мощного ингибитора сукци-натдегидрогеназы, оно также и лимитирует возможную скорость синтеза цитрата. В самом деле, равновесная концентрация оксалоацетата в этой реакции намного меньше Кт цитрат-синтазн. Поэтому предполагается, что малатдегидрогеназа и цитрат-синтаза могут быть физически очень сближены внутри митохондриального матрикса для того, чтобы в нужном количестве обеспечивалось необходимое для синтеза цитрата поступление субстрата — оксалоацетата.

12.2.3. Цикл лимонной кислоты: стерические аспекты

12.2.3.1. Биологическая асимметрия лимонной кислоты

Лимонная кислота не имеет асимметрично замещенного атома углерода и поэтому не обладает оптической активностью. Это обстоятельство дало повод ожидать, учитывая реакции, изображенные на рнс. 12.1, что введение 1-14С-ацетил-СоА в метаболический путь приведет к образованию ?-кетоглутарата, в равной степени меченного по обеим карбоксильным группам. Однако в действительности продукт, получавшийся в этих экспериментах, оказался меченным исключительно по углероду ?-карбокснла:

НООС—СН2

НО—С—СООН + NAD ь

НООС—СН.

'г

0=С—СООН + NADH -f- Н+

щавелевоуксусная кислота

•СН314СО—СоА

?

Н2С—"СООН

а

412

III. МЕТАБОЛИЗМ

CH2COOH

*¦ поверхность г.имметрии

Рис. 12.5. Асимметрия, выявляемая при присоединении лимонной кислоты к поверхности фермента в трех точках. Центральный атом углерода лнмониой кислоты находится в центре равностороннего четырехгранника. Наличие плоскости симметрии делает молекулу в растворе фермента оптически неактивной. Если поверхность фермента асимметрична и присоединение молекулы лимонной кислоты может осуществиться только за счет —ОН-, —СООН- и —СН2СООН-групп так, как это показано, тогда лишь одна плоскость четырехгранника (заштрихованная крест-накрест) может разместиться на поверхности фермента. Следовательно, две группы —CHjCOOH не равноценны и лишь одна из них прикрепляется к поверхности фермента.

Именно это наблюдение привело к признанию того, что, как это показано на рис. 12.4 и 12.5, две —СН2СООН-группы лимонной кислоты геометрически истинно неравноценны и что эта неравноценность становится очевидной при присоединении молекулы лимонной кислоты к поверхности фермента в трех точках. Хнраль-ность атома углерода, который не является оптически активным в обычном смысле, отмечалась ранее при синтезе цитрата.

Каждая стадия цикла лимонной кислоты полностью стереоспе-цифична (рис. 12.1). Как уже говорилось, аконитаза легко различает две —СН2СООН-группы лимонной кислоты, так что последовательное отнятие и присоединение воды специфически приводят к rpeo-Ds-изоцитрату. Возможность проследить судьбу каждого атома водорода во всей последовательности реакций иллюстрируется схемой, приведенной на рис. 12.1. В то время как на 1 моль потребленного ацетил-СоА образуется 2 моля С02, ни один из атомов углерода, выделенных в виде С02, не происходит из этого ацетил-СоА на первом обороте цикла. На уровне свободного сукцината происходит рандомизация, и изотоп, введенный в форме 14С-карбоксильного углерода остатка ацетата в ацетил-СоА, симметрично распределяется относительно плоскости симметрии. На последующих оборотах цикла по мере образования и утилизации оксалоацетата углерод ацетила выделяется в виде С02.

12. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. 1

413

12.2А. Регуляция цикла лимонной кислоты

Основные процессы, которые поставляют и запасают энергию в клетках, могут быть в общей форме изображены следующим образом:

пируват -> ацетил-СоА жирные кислоты

^ADP

•АТР

СО,

Регуляция этой системы inter alia должна гарантировать постоянное поступление АТР соразмерно с существующими в данный момент энергетическими потребностями, обеспечивать превращение избытка углеводов в жирные кислоты через пируват и ацетил-СоА и наряду с этим контролировать экономное расходование жирных кислот через ацетил-СоА как ключевой продукт для входа в цикл лимонной кислоты с тем, чтобы ограничить потребление пирувата в случае дефицита углеводов.

Цикл лимонной кислоты поставляет электроны в электронпере-носящую систему, в которой поток электронов сопряжен с синтезом АТР. и в меньшей степени снабжает восстановительными эквивалентами системы биосинтеза промежуточных продуктов, которые вливаются также в другие метаболические пути. В принципе цикл не может протекать быстрее, чем это позволяет использование образуемой АТР. В предельном случае при обязательном сопряжении потока электронов и синтеза АТР, если бы весь ADP клетки превратился в АТР, не могло бы быть никакого даль-: нейшего потока электронов от NADH, который накапливается, к 02. Ввиду отсутствия NAD+, необходимого участника процессов дегидрирования цикла, последний перестал бы функционировать. В дополнение к этой грубой взаимосвязи существуют более тонкие регуляторные приспособления, которые модулируют действие ферментов в самом цикле лимонной кислоты.

Сукцинатдегидрогеназа находится во внутренней митохондриальной мембране. Все остальные ферменты цикла лимонной кислоты растворены в матрпкее, заполняющем внутреннее пространство митохондрии. Измерения относительных количеств этих ферментов и концентраций их субстратов (в стационарном состоянии) в митохондриях, снабженных ADP и ?,·, указывают на то, что индивидуальные стадии процесса «пригнаны» друг к другу; каждая из реакций протекает с одинаковой скоростью, как им, конечно, и полагается. Как только пируват (или другой потенциальный источник ацетил-СоА) поступает внутрь матрикса митохондрии, весь цикл протекает внутри этого отсека. Относительно немногие субстраты

•414

III. МЕТАБОЛИЗМ

могут пересекать вну