роте цикла потребляется 1 молекула аце-тил-СоА и выделяется 2 молекулы С02. Щавелевоуксусная кислота, вступающая в конденсацию, регенерируется, в результате чего обеспечивается непрерывное протекание процесса до тех пор, пока ацетил-СоА продолжает поступать в цикл, а атомы водорода и С02 удаляются из него. Из числа индивидуальных реакций цикла четыре относятся к реакциям дегидрирования, причем три из: них приводят к образованию NADH. Итоговое уравнение для цикла лимонной кислоты (один оборот) можно записать следующим образом:

ацетил-СоА-»· 2С02 + СоЛ + 4(2е)

Электроны переносятся к 02 по электронпереносящей цепи, которая рассматривается позднее, а свободная энергия, освобождающаяся в ходе этого процесса, сохраняется в форме АТР. Таким образом, за счет окисления ацетил-СоА в цикле лимонной кислоты клетки получают большую часть всей той потенциальной энергии, которая должна освободиться при окислении глюкозы, жирных кислот и аминокислот. Теперь можно рассмотреть более подробно индивидуальные реакции цикла.

12.2.1. Пируватдегидрогеназа и образование ацетильного производного кофермента А

Молекула кофермента А состоит из аденозин-3'-фосфат-5'-пиро-фосфата, соединенного сложноэфирной связью с пантотеновой кислотой (витамином), которая в свою очередь соединяется амидной связью с ?-меркаптоэтиламином. Рассматриваемая здесь ацетильная группа образует с серой кофермента А тноэфирную связь,. Здесь для кофермента А приняты сокращения СоА илн СоА—SH (группа —SH обозначает сульфгидрильную группу кофермента А, а не дополнительную сульфгидрильную группу).

Ацетил-СоА участвует в множестве биологических процессов. Как следует из дальнейшего, ацетил-СоА — предшественник в сии-

\i. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

399

соон

-с—нв I

с=о

соон

щавелевоуксусная кислота

••соон I

п.—с—н; I

м-с—он I

Тсоон

яблочная

-нон ?

^cooh

С-

HOOC^ ^H фумаповая

кислота

Н„—С—?,

I

»соон

янтарная кислота

сн.-со—SCацетил-СоА

соон

н,—с—н;

I

-> ноос—с—он

I

-н,

¦ соон лимонная кислота

-нон

^cooh

"соон

¦соон

х^с-аконитовая кислота

соон

I

н—с—он I

ноос—с—н* I

н«—с—н,

¦соон

mpeo-Ss- иэолимонная" кислота

соон I

- с=о

I

HL—с— н„ I

Hr— с— н„

'соон

Ot'-кетоглутарриач кислота

Рис. 12.1. Главные промежуточные продукты цикла лимонной кислоты. Углеродный атом карбоксильной группы ацетил-СоА (отмечен ромбиком) прослеживается в процессе всего цикла. Две карбоксильные группы янтарной кислоты равноценны, и поэтому, если карбоксильный углерод ацетил-СоА вводится в виде ,4С, метка распределяется равномерно между обоими карбоксилами четырехуглсрод-иых дикарбоновых кислот (отмечены треугольниками). Атомы водорода, вошедшие в С—?-связи при присоединении воды к двойной связи, отмечены звездочкой (* ), а водородные атомы, перенесенные к пиридиниуклеотндам, обозначены точкой (·)· Каждая из четырех окислительных реакций показана как потеря 2Н. Индексы указывают хиральность атомов водорода.

400

III. МЕТАБОЛИЗМ

тезе жирных кислот и стероидов из углеводов; он может утилизироваться в синтезе ацетоуксусной кислоты, а также служит ацетили-рующим агентом, доступным для других разнообразных синтетических процессов.

- сн3

ацетил

айеиозин з'-фосфат-5-пирофосфат

ОН

ацетилированная форма тоферменгла А (ацетил-СоА или ацетил-S-CqA)

Синтез ацетил-СоА непосредственно из ацетата может осуществляться некоторыми организмами, а также происходить в печени и нервной ткани. Для активации ацетата требуется аденозинтри-фосфат АТР; продукты реакции-—адениловая кислота (AMP) и неорганический пирофосфат (РРг). Реакция протекает в две стадии, катализируемые одним ферментом — ацетат-тиокиназой:

АТР + ацетат +=±l ацетил-АМР + РРг (1 >

ацетил-АМР + СоА +=± A MP + ацетил-СоА (2> АТР + ацетат -f СоА :?=>Г AMP + РРг + ацетил-СоА "

Ацетил-АМР представляет смешанный ангидрид уксусной кислоты и фосфата адениловой кислоты. Ранее (разд. 10.3) приведена общая структура ациладенилатов. Во время реакции свободный ацетил-АМР не появляется, что характерно для всех систем реакций, в которых какой-либо ациладенилат участвует в качестве промежуточного продукта. Ацетиладенилат прочно связан в локусе своего образования на ферменте, и последующая реакция происходит с этим связанным с ферментом промежуточным продуктом. Подобные связанные с ферментом ациладенилаты образуются в качестве промежуточных продуктов при активации жирных кислот

12. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

401

с длинной цепью (гл. 17) и аминокислот (гл. 26). Приведенная последовательность реакций представляется вполне вероятной, поскольку взаимодействие СоА и синтетического ацетил-АМР в качестве субстратов [реакция (2)] катализируется ацетат-тиокина-зой, а фермент только в присутствии ацетата катализирует обмен 32PPi с АТР, т. е. путем обращения реакции (1). Однако дрожжевая ацетат-тиокиназа также катализирует обратимую реакцию

ацетил-СоА + дефосфо-СоА < > ацетил-дефосфо-СоА -f- СоА

что позволяет предположить участие ацетил-фермента в качестве промежуточного продукта. Гидролиз ацетил-СоА:

СН3СО—SCoA -f- НОН <-г^ СН3СОО- + HS—СоА+ Н+

протекает с изменением свободной энергии AG° приблизительно на —10 000 кал/моль. Именно эта энергия обусловливает возможность функционирования ацетил-СоА в процессах биологического ацети-лирования и представляет собой «движущую силу» синтеза лимонной кислоты. Поскольку совершенно очевидно, что ацетил-СоА — высокоэнергетическое соединение, реакция, катализируемая апетат-тиокиназой, должна быть легко обратимой. В живой клетке течение реакции в направлении синтеза ацетил-СоА из ацетата обеспечивается фактически необратимым гидролизом неорганического пирофосфата до двух молекул ортофосфата под действием неорганической пирофосфатазы, причем AG° этой реакции составляет около —7500 кал/моль. ·

Однако сам ацетат не является обязательным промежуточным продуктом в метаболизме глюкозы. Как указывалось выше, в цитоплазме животных клеток метаболизм глюкозы протекает в последовательности реакций, названной гликолизом, где каждая молекула глюкозы превращается в две молекулы пирувата (гл. 14). Этот процесс можно суммарно записать следующим образом:

СеН12Ое + 2NAD+ ->- 2СН3СОСООН + 2NADH f 2Н+

Пируват представляет собой как бы «точку разветвления» метаболизма. Он может обратно превратиться в глюкозу, восстановиться посредством NADH до лактата или переаминироваться с образованием аланина (гл. 20). Связь между процессом образования пирувата, происходящим в цитоплазме и циклом лимонной кислоты в митохондриях реализуется через синтез ацетил-СоА. Этот процесс происходит в матриксе митохондрии и катализируется прочно связанной мультиферментной единицей, получившей название пиру-ватдегидрогеназного комплекса. Комплекс состоит не меньше чем из трех белков, которые используют пять коферментов (тиаминпи-

26—1148

402

III. МЕТАБОЛИЗМ

рофосфат, липоевую кислоту, кофермент A, FAD и NAD^). Суммарная реакция фактически необратима (ДС°=—8000 кал/моль):

СНо СНо

С=0 + СоА—SH + N AD+ I

СООН

С=0 + С02 + NADH + Н+ I

S—СоА

Начальной стадией является реакция между пируватом и связанным с соответствующим ферментным белком тиаминпирофосфа-том (ThPP), который представляет собой пирофосфат витамина Bi (гл. 50); в результате этой реакции выделяется С02 и образуется а-оксиэтилтиаминпирофосфат:

nh, n

сн3

I .

нсон;

_|-------

,с—S

?' г—сн,—n

ii 2 \ i с—ca jch с=с—сн2—снг

о

сн,

о—р—о I

о- о

о II

-р—о-

ос- оксиэгпилглиаминпирофосфат

Оксиэтильная группа, находясь на уровне окисленности аце-тальдегида и будучи все еще связанной на поверхности того же фермента, реагирует с дисульфидной формой липоевой кислоты; последняя присоединена ко второму ферментному белку комплекса путем образования амидной связи с ?-аминогруппой его лизиново-го остатка. В этой реакции дисульфидная группа липоевой кислоты восстанавливается до двух сульфгидрильных групп, одна из которых образует эфир с ацетатом, возникшим в результате окисления С2-фрагмента пирувата:

сн3 I

неон

J-*

* + r-n( I

сн—s с=с-I

,сн2—S

ей

ThPP

+

сн,—sh

(СН2)4

conhrl згипоамив

сн,

сн—s I

(СН2)4 conhr,

о ii

-с I

сн,

CH2-SH СоА

сн, + S

1=°

сн,

ацегпил-липоамиЭ

nch—sh

I

(СН2)4

conhrl

бигийро-гмпоамиЭ

ацетил--СоА

Й-оксиэтилти-аминпиро-фосфэгл

Ацетильная группа затем переносится к сульфгидрильной группе СоА с образованием ацетил-СоА. Последний отделяется от поверхности фермента, оставляя связанный с ферментом остаток ли-

12. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. I

403:

поевой кислоты в дисульфгидрильной форме. После этого дисульф-гидрильная форма вновь окисляется до дисульфидной при участии третьего белкового компонента комплекса, который содержит связанный FAD, и, наконец, восстановленный FAD окисляется присутствующим в среде NAD+. На этом весь процесс завершается, и три связанных с ферментами кофермента оказываются в своем исходном состоянии и пригодны для следующего цикла:

CHj—SH

снг + fad

сн—sh

(сн2)4 conhrb

сн2—s nad+

с4 I + fadh2 fad + nadh + н+

сн—s I

(сн2)4 conhr,

Эти реакционные последовательности, в которых участвуют три связанных и два диссоциирующих кофермента, объединены в организованном мультиферментном комплексе, который в животных клетках характеризуется молекулярной массой ~9·106. Комплекс состоит из трех отдельных ферментов. Первый из них, пируватдегид-рогеназа, представляет собой тетрамер из двух ?-цепей (мол. масса 36 000), несущих тиаминпирофосфат, и двух ?-цепей, необходимых для переноса Сг-единицы к остатку липоевой кислоты, который связан со следующим ферментным комплексом — дигидро-

LTA

Рис. 12.2. Схематическое изображение предполагаемого вращательного движения липоиллизилового остатка между ?-оксиэтилтиамиипирофосфатом TPP-Ald, связанным с пнруватдегидрогеназон d, пунктом переноса ацетила к СоА. и реактивной дисульфидной группой флавопротеида, днгндролипоилдегидрогеназы F. Ли-поиллизиловый остаток является интегральн