вных систем и реакционных путей в этих фракциях.

11.4.2.3. Применение изотопных индикаторов

Доступность изотопов позволяет метить молекулы для того, чтобы просле-.дить направление метаболических превращений специфических участков их •структур. Кроме того, метод изотопных индикаторов очень удобен для маркировки специфических участков или активных центров больших молекул, например ферментов. Введение метки особенно важное значение приобретает при :изученин метаболизма обычных компонентов организма, за превращением которых, когда они вводятся, с помощью других способов невозможно следить, поскольку они неотличимы от таких же молекул, уже присутствующих в теле животных. Использование изотопов открывает возможности для таких исследовании потому, что химические различия между изотопами любого данного элемента ничтожны, а скорости реакции изотопных соединений доступны для регистрации.

Чаще всего работают с изотопами наиболее распространенных элементов, входящих в состав органических соединений, а именно ?, ?, С, S, ? и О. Кроме того, используются изотопы I, Na, К. Fc и Са. Помимо стабильных изотопов Н(2Н), N(1SN) и 0(180) особенно широкое применение получили нестабильные (радиоактивные) изотопы. Количественное измерение радиоактивности технически проше, чем определение стабильного изотопа. Доступность радиоактивных изотопов с относительно большими периодами полураспада делает возможным их использование в длительных экспериментах. Чувствительные методы измерения радиоактивности в сочетании с бумажной и тонкослойной хроматографией и электрофорезом — мощное средство для обнаружения и идентификации соединений в процессе экспериментальной работы.

Биологические приложения метода изотопных индикаторов. Первое соображение, возникающее при приложении изотопной методики к решению биологических проблем, касается формы, в которой вводится изотоп. Во многих экспериментах изотопный атом может входить в состав простой молекулы: "С02, ^HsO, 3Н20, 2ЧЧаС1, NaH332P04, К1311. В других экспериментах органические соединения, помеченные по одному или нескольким составляющих их атомам, елс-Л.уст сначала получить путем органического синтеза или биосинтеза. Так, меченый сывороточный альбумин можно приготовить путем включения меченой аминокислоты в рашюн животного и последуюшего выделения альбумина из плазмы животного. Подобным же образом ИС может быть «встроен» в глюкозу при условии проведения фотосинтеза (гл. 16) в атмосфере МС02 с последующим

П. ОБЩИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА

гидролизом крахмала, который накапливается в листьях. Нередко требуется включение более чем одной изотопной метки в одно и то же вещество. Такого рода задача возникает, например, при исследовании путей превращения как углеродного скелета, так и атома азота аминокислоты глицина. Для решения этой задачи можно синтезировать 14С-глицин и 'ЧМ-глицин отдельно и затем, просто смешав эти два продукта, получить то, что в сущности представляет собой материал с двойной меткой. Соединения с более чем одной изотопной меткой могут также синтезироваться методами, которые приводят к включению более чем одного изотопа в одну молекулу.

Изотопы широко применяются в исследовании взаимоотношений между предшественником и продуктом, т. е. для выяснения того, превращается ли соединение А в соединение В в организме. В таких экспериментах вводят меченое соединение А, затем соединение В выделяют, тщательно очищают и проводят определение изотопа. Применение этой методики оказалось особенно полезным для обнаружения в организмах животных реакций, которые ранее были доступны для исследования только в более простой системе. Посредством расшепле-ния вещества и выяснения распределения изотопа среди его атомов можно получить сведения о механизме его превращения.

Метод изотопных индикаторов исключительно важен для измерения скоростей процессов, особенно в случае интактных животных. Количество любого тканевого компонента может быть довольно постоянным у находящегося в состоянии равновесия взрослого животного, но это постоянство в действительности есть результат равновесия между скоростями синтеза и распада этого компонента. До применения изотопных индикаторов не было ни одного удовлетворительного метода для измерения скоростей этих процессов. С помощью изотопных индикаторов проведены исследования двоякого рода. В одном варианте пул данного соединения в организме предварительно метится посредством введения меченого материала, и затем следят за постепенным исчезновением изотопа. В другом варианте вводится меченый изотопом предшественник и исследуется появление изотопа в продукте его превращения. Из скоростей изменения концентрации вещества, содержащего изотопную метку, могут вычисляться скорости его синтеза и распада. Такого рода исследования привели к возникновению концепции о непрерывном обновлении (синтез, распад и замена) определенных составляющих организма, что отражает динамическое стационарное состояние даже при постоянном составе.

Метод меченых индикаторов находит применение и при изучении вопроса об анатомическом распределении того или иного вещества. В этих экспериментах после введения изотопного материала проводят определение изотопа в различных тканях н полученных из них продуктах, чтобы выяснить, каким образом распределяется между ними атом изотопа. В опытах с радиоактивными изотопами можно использовать дополнительное экспериментальное средство — авторадиографию. При этой методике на тканевый срез налагается фотографическая пленка. После соответствующей экспозиции и проявления участки пленки, расположенные близко к радиоактивным областям ткани, должны потемнеть. Применение изотопов с требуемыми в этих опытах радиационными характеристиками позволяет осуществить разрешение на внутриклеточном уровне.

Метод изотопных индикаторов нашел также широкое применение для оценки содержания тех биологических веществ, количество которых в тканях и жидкостях тела очень мало. Сочетая специфические иммунологические методики с методом изотопных индикаторов, можно оценить количество некоторых компонентов крови, например белковых и полипептидных гормонов, а также метаболитов с низкой молекулярной массой. Этот подход, названный радиоиммунным анализом, основан на образовании у экспериментального животного, например у кролика, либо антитела в результате инъекции, либо антигенного белка, например полипептидпого гормона, либо вещества с низкой молекулярной массой, которое само по себе не обладает антигенными свойствами, но превращается в гиптеи при ковалентпом связывании с определенным белковым переносчиком

392

III. МЕТАБОЛИЗМ

(гл. 29). Образующееся антитело, направленное против введенного антигена или гаптена, можно легко пометить (обычно иодом-125). Меченая молекула антитела используется для проведения специфической реакции антитело — антиген •в биологической жидкости; с помощью соответствующих методов можно сравнить количество введенной с антителом радиоактивной метки с количеством мет-гки, которое связалось с антигеном в ходе указанной реакции. Во втором варианте анализа меченый антиген используется для того, чтобы вытеснить немеченый антиген или гаптен в биологическую жидкость после обработки последней избыточным количеством немеченого антитела. Количество связавшегося при этом меченого антигена можно легко рассчитать, пользуясь калибровочными кривыми, построенными для чистого антигена (в различных концентрациях относительно соответствующей ему сыворотки).

Эти методики позволяют точно измерять нанограммовые количества веществ и, кроме того, решить такие проблемы, как скорость исчезновения (время полупревращения) введенного вещества, скорость распада вещества в сосудистой системе, локализация введенных веществ в тканях-мишенях, а также степень связывания их со специфическими рецепторами.

Литература

Книги

Allen I. ?., ed.. Molecular Organization and Biological Function, Harper and Row, Publishers, Inc., New York, 1967.

Berson S. ?., Yalow R. S., eds., Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology, pt. I, General Methodology, North-Holland Publishing Company, Amsterdam, 1973.

Birnie G. D.. ed.. Subcellular Components: Preparation and Fractionation, Butter-worths, London, 1976.

Bittar ?. E., ed.. Membranes and Ion Transport, vols. 1—3, Academic Press, Inc., New York, 1970, 1971.

Bourne G. H., Division of Labor in Cells, 2d ed., Academic Press, Inc., New York, 1970.

Bresnick E., Schwartz ?., Functional Dynamics of the Cell, Academic Press, Inc., New York, 1968.

Chase G. D., Rabinowitz J. L., Principles of Radioisotope Methodology, 2d ed.,

Burgess Publishing Company, Minneapolis, 1962. Christensen ?. N., Biological Transport, 2d ed., Addison-Wesley-W. A. Benjamin,

Inc.. New York, 1972.

Cook I. S., Biogenesis and Turnover of Membrane Macromolecules, Raven Press, New York, 1976.

CuPraw ?. I., Cell and Molecular Biology, Academic Press, Inc., New York, 1968.

Ernster L., Estabrook R. №.. Slater E. C, eds., Dynamics of Energy-Transducing Membranes, Elsevier, Amsterdam, 1974.

Carrod A. E., Inborn Errors of Metabolism, reprinted with supplement by H. Harris, Oxford University Press, Fair Lawn, N. J., 1963.

Oreengard P., Robison G. ?., eds., Advances in Cyclic Nucleotide Research, vols. 1 and 2, Raven Press, New York, 1972.

Harris E. /., Transport and Accumulation in Biological Systems, 3d ed., University Park Press, Baltimore. 1972.

Loewy A. G., Siekevitz P., Cell Structure and Function, 2d ed., Holt, Rinehart and Winston, Inc., New York, 1969.

11. ОБЩИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА

393

Nicolson С. L., Raftery ?. ?., Rodbell ?., Fox С. F., eds., Cell Surface Receptors, Alan R. Liss., Inc., New York, 1976.

Novikoff А. В., Holtzman E., Cell and Organelles, 2d ed., Holt. Rinehart and Winston, Inc., New York, 1976.

Ravin B. R., Freedman R. В., eds., Effects of Drugs on Cellular Control Mechanisms, University Park Press, Baltimore, 1972.

Revel I. P.,