ие развития мутант-ных штаммов. В этом смысле человеческие мутанты напоминают микроорганизмы, у которых существование мутации проявляется в форме неспособности организма осуществлять отдельное метаболическое превращение или группу превращений (гл. 25). Такие бактериальные мутанты оказались очень подходящими для выяснения путей биосинтеза.

Большинство аномалий в метаболизме независимо от того, вызваны ли они необычной диетой, наркотиками, ядом или болезнью, отражает изменения специфических скоростей одного или нескольких процессов. Эти изменения в скоростях могут в свою очередь привести к изменениям в составе тела, которые, однако, могут быть поняты только при исследовании скоростей процессов. Например, концентрация глюкозы в крови здорового животного относительно постоянна. Однако, как известно, глюкоза быстро утилизируется, и наблюдаемое постоянство ее содержания в крови в действительности является результатом деятельности сложной совокупности механизмов, которые обеспечивают равновесие между скоростями образования н использования глюкозы. В аномальных условиях концентрация глюкозы в крови может подняться; такое повышение — важный признак сахарного диабета. Очевидно, что это повышение концентрации может быть связано с аномальным понижением скорости утилизации глюкозы или с повышением скорости ее образования. Правильное применение изотопных методов (разд. 11.4.2.2) позволяет проанализировать такого рода проблемы с точки зрения индивидуальных скоростей реакций и дает возможность углубленного понимания аномальных ситуаций.

Экспериментальные фистулы. С помощью хирургических методов создают фистулы у экспериментальных животных; это даст возможность отбирать пробы крови или лимфы, поступающих в определенные органы и выходящих из них, а также собирать секреты, выделяемые на различных отрезках желудочно-кишечного тракта или желчных протоков. Использование фистул позволяет изучать реакции, осуществляемые отдельным органом пли тканью.

Катетеризация кровеносных сосудов. Степень участия отдельного органа в метаболизме можно оценпть путем сравнения химического состава притекающей к нему артериальной крови н оттекающей венозной крови. Метод катетеризации сосудов позволяет также осуществлять отбор проб крови и вводить специфические вещества в артериальный кровоток. Этот способ прижизненного исследования соответствует методу перфузии изолированного органа in vivo, описанной ниже, и лополняст метод фистул.

Описанные выше экспериментальные методики включают процедуры, проводимые in vivo. Вместе с тем целый ряд исследований метаболизма может производиться in vitro. Некоторые из них описаны ниже. Однако данные, полученные в экспериментах in vitro, следует интерпретировать с осторожностью. Так извлечение органа или ткани нз их естественной среды и использование части

25*

388

III. МЕТАБОЛИЗМ,

органов (см. ниже) для исследования явлений метаболизма исключает огромное число регуляторных воздействий, которые испытывает in vivo каждый орган или ткаиь. Тем не менее применение разнообразных методов in vitro позволило получить важные сведения о метаболических реакциях в живом организме.

11.4.2.2. Методы in vitro

Перфузия органа. Используя метод перфузии изолированного органа in vitro, можно вводить то или иное вещество и выяснить путь его превращения с помощью анализа выходящей из органа жидкости. Орган помещают в замкнутую систему, в которой циркулирует соответствующая обогащенная кислородом жидкость под повышенным давлением. В состав циркулирующей среды может входить дефибринированная или цельная кровь, содержащая соответствующий антикоагулянт (гл. 29) или эритроциты, суспендированные в растворах физиологически изотонических солевых смесей, которые должны имитировать нормальную плазму по рН, ионной силе и ионному составу. Этот подход используют при исследовании печени, сердца, почек и тонкого кишечника; такие опыты способствуют пониманию роли этих органов в метаболизме. Результативность перфузии органов в изучении метаболизма сильно возросла после разработки методик, в которых изотопно меченный метаболит перфузируется в течение очень короткого периода, и метаболизм резко останавливают быстрым замораживанием ткани («ледяные тиски»); таким образом удается выяснить распределение изотопа среди множества родственных метаболитов в течение нескольких секунд после его введения и через последующие фиксированные интервалы времени.

Метаболизм тканевых срезов, измельченных препаратов и препаратов разрушенных клеток. В 1912 г. Варбург начал исследования метаболизма тканевых срезов с использованием манометрической техники. Количественные изменения объема или давления газа регистрировались в приборе, предложенном ранее Холдейном. Метод Варбурга позволил исследовать метаболизм маленьких фрагментов определенной ткани или органа путем манометрического измерения скорости потребления 02 и выделения С02 (дыхательный коэффициент; см. разд. 11.1.2). С помощью этого метода можно измерить также скорость утилизации какого-либо питательного вещества пли субстрата, добавленного в среду, в которую помещена ткаиь, и определяют природу и количество метаболитов, образующихся в течение эксперимента. Этот метод получил применение при работе со срезами ткани, гомогенатами ткани, препаратами разрушенных клеток или бесклеточиыми препаратами (см. ниже).

Исследования культуры ткани. Клетки и ткани могут выращиваться только в среде точно установленного состава. Эта способность клеток могла быть использована для исследовательской работы главным образом благодаря выделению и идентификации незаменимых факторов роста, например витаминов и аминокислот, требующихся для размножения клеток. Метод культуры ткани позво| ляет исследовать биохимические процессы в растущих популяциях животных клеток и в ряде последовательных клеточных генераций. В культуре ткани выращено множество различных типов клеток, как нормальных, так и злокачественных, которые принадлежат нескольким видам млекопитающих, а также человеку. Метод культуры ткани также является подходом к изучению распространения вируса в клетках, позволяя исследовать вирусную репликацию и химические изменения, индуцированные вирусным агентом в клетке хозяина in vitro, а также лучше понять сущность опухолевых изменений, вызываемых некоторыми вирусами.

Исследования с использованием микроорганизмов. Микроорганизмы представляют для биохимика возможность работать с простыми живыми формами, удобными для лабораторных исследований. Эти низшие формы имеют сравнительно простые потребности для своего роста и развития, они быстро воспроиз-

П. ОБЩИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА

389

водятся и обычно могут выращиваться в больших количествах. Микроорганизмы — хороший источник для получения препаратов отдельных ферментов и препаратов разрушенных клеток для изучения метаболических превращений. Нередко микроорганизмы могут использоваться с целью осуществления химических превращений, которые химику-органику трудно воспроизвести, или с целью получения соединений, которые ие столь просто синтезировать в лабораторных условиях. Кроме того, мутантные штаммы микроорганизмов можно легко получить в условиях эксперимента. Большой вклад, который внесли исследования с микроорганизмами в наше понимание биохимической генетики, рассмотрен в гл. 25—28.

Исследования с бесклеточными системами. При разрыве плазматической мембраны освобождаются компоненты клетки. Методом дифференциального

Таблица 11.1

Распределение типичных клеточных компонентов, полученных дифференциальным центрифугированием препарата разрушенных клеток печени

Фракция

Величина центробежного поля для разделения, g

Время центрифугирования.

Обломки клеток; ядра; 1 000—6 000 10 мембраны

Митохондрии (см. гл. 12) 10000—15 000 "0

Лизосомы; фрагменты микротрубочек; перокси-сомы

Растворимая фракция или супернатант (цито-золь)

15 000—20 000 30

Некоторые фе рмен ативиые или другие активности3

Синтез нуклеиновых кислот (ядра)

Перенос электронов; окислительное фосфорилирование; цикл лимонной кислоты; окисление жирных кислот, окисление аминокислот; синтез мочевины; удлинение цепи жирных кислот

Гидролазы; ферменты, образующие и разрушающие ??02

Синтез белков; гидро-ксилирующие системы; цитохром Ь5; гликозил-трансферазы; синтез му-кополисахаридов, фосфоглицеридов, триацил-глицеринов и стероидов; редуктазы стероидов; фосфатазы

Гликолитическая система; гексозомонофосфат-ный путь; синтез гликогена, гликогенолнз; синтез жирных кислот; катаболизм пуринов и пиримидинов; пептидазы; аминоацилсинтетазы; аминотрансферазы

Микросомы (фрагмента- 100 000 60 рованная эндоплазматическая сеть); рибосомы; мембраны эидоплазматической сети; мембраны Гольджи

в Указанные активности обсуждаются в последующих главах.

390

III. МЕТАБОЛИЗМ

.центрифугирования (см. ниже) удается разделить неразрушенные клетки, различные клеточные органеллы и субклеточные частицы, что позволяет исследовать их структуру посредством световой, фазово-контрастной и электронной микроскопии, гистохимическими и цитохимическими методами, а также оценить их метаболический вклад в процессы, совершающиеся в клетке.

Для разрушения клеточных мембран суспензию клеток в соответствующей гизотонической среде, например в 0,25 ? сахарозе, подвергают воздействию ультразвуковых колебаний или обрабатывают клетки в механическом гомогенизаторе, вращение пестика которого производится вручную или механически; в результате действия на ткань развивающейся при этом силы трения получаются препараты разрушенных клеток, не совсем точно называемые гомогената-ми. Эти препараты содержат мало целых клеток и представляют собой суспензии ядер, митохондрий, микросом, других клеточных органелл и фрагментов плазматических мембран, а также растворимую фазу цитоплазмы — цитозоль. При помощи дифференциального центрифугирования суспензии разрушенных клеток при низких температурах разделяют на индивидуальные фракции. В табл. 11.1 представлены типичные фракции, полученные этим методом, и дано распределение нескольких важнейших ферментати