и высоких концентраций глицерина или сахарозы. Са2+ в миллимолярных концентрациях иигибиру-ет полимеризацию микротрубочек. Предполагается, что изменение внутриклеточной концентрации Са2+ играет регуляторную роль в сборке-разборке мнкротрубочек. Роль микротрубочек в ограничении латеральной подвижности компонентов плазматической мембраны описана ранее (разд. 11.2.1).

11.3.3.8. Микрофиламенты

Многие типы клеток содержат тонкие цитоплазматические нити {филаменты), состоящие в основном из белка. Подобно микротрубочкам, филаменты участвуют в поддержании стабильности клеточной структуры и в клеточном движении. Последняя функция особенно очевидна для специализированных микрофиламентов. Волокно поперечнополосатой мышцы содержит много длинных мио-фибрилл, состоящих нз правильно расположенных тонких фила-ментов, участвующих в мышечном сокращении (гл. 36). Микрофиламенты других клеток также содержат белки, очень напоминающие актин мышцы. Микрофиламенты участвуют не только в точно ориентированном движении компонентов цитоплазмы, включая и подвижность мембранных компонентов субклеточных орга-нелл и плазматической мембраны, но и вносят свой вклад в ранее описанное явление ограничения степени разжиженности плазматической мембраны (разд. 11.2.1) цитосклетным ансамблем, образуемым микрофиламентамн и микротрубочками.

11.4. Экспериментальные подходы к изучению метаболизма

Разработка многих методик преследовала цель выяснить природу химических реакций, происходящих в живых системах, и измерить влияние тех или иных параметров на скорости этих реакций в здоровых и больных организмах.

11. ОБЩИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА

385

В экспериментальной науке в отличие от теоретической исследуемую систему помещают в те или иные условия, измеряют некоторый (е) параметр (ы) и устанавливают связь этого (их) параметра (ов) с условиями. Современный уровень понимания метаболизма достигнут с помощью различных экспериментов, включающих такие, при которых животному не наносилось никаких непосредственных повреждений (добавление в пищу животного ничтожного количества помеченного изотопами питательного вещества) и даже принесение животного в жертву (удаление органа, выделение из него фермента и измерение кинетики реакции, катализируемой этим ферментом).

11.4.1. Уровни организации

В интактном организме содержащиеся в нем субстраты и ферменты находятся в определенных пространственных и химических взаимоотношениях. Скорости, с которыми вещества вводятся в данную ткань или выводятся из нее, зависят от активности других тканей и могут соответствующим образом меняться. Многие процессы регулируются продуктами, выделяемыми в кровоток в отдаленных от данной ткани пунктах. Благодаря наличию мембран достигается установление определенных скоростей, с которыми субстраты входят в клетки и внутриклеточные отсеки (компартменты) или покидают их. Поэтому скорость, с которой в нормальной печени выполняются in situ различные реакции, может отличаться от скорости, с которой в том же органе, но после изолирования и перфузии (разделения иа срезы или измельчения) осуществляются те же самые процессы. Хотя исследование интактиого животного представляет много экспериментальных трудностей, существует ряд способов для выяснения природы происходящих в нем процессов. Сюда относятся кормление пищевым рационом, в котором отсутствует то или иное обычное питательное вещество, введение с пищей или парэнтерально либо аномального материала, либо избытка обычного питательного вещества, введение животному какого-либо метаболита, меченого таким образом, чтобы последующее распределение метки могло быть исследовано. Множество хирургических методов также дает экспериментатору возможность подхода к изучению отдельных тканей или жидкостей тела. Эти методы включают создание фистул различных участков желудочно-кишечного тракта, желчных протоков или лимфатической системы, а также взятие проб крови в различных пунктах кровеносной системы. Исследование влияния частичного или полного удаления того или иного органа также оказывается результативным, хотя при этом нарушения жизнедеятельности организма намного более велики.

Следующий уровень организации, на котором ведутся исследования, представлен перфузируемыми выделенными органами. Исследования на этом уровне могут сопровождаться утратой некоторых регуляторных механизмов, например гормонального и/или нервного контроля, которые действуют на орган при его нормальном расположении в организме. Однако подобные эксперименты оказались результативными для выявления органа, в котором протекает та или иная реакция, и выяснения природы продуктов, которые могут образовываться после добавления определенного предшественника в перфузионную жидкость.

Еще один уровень организации — это орган, разделенный на срезы. Печень, почки, мозг и другие ткани могут быть разделены на срезы толщиной ~ 50 мкм; омываемая ожидкостью поверхность этих срезов достаточно велика для того, чтобы в течение нескольких часов мог поддерживаться необходимый для жизне теятельности обмен питательных веществ и продуктов выделения. Часть клеточных мембран надрезается в процессе изготовления срезов, но большинство клеточных компонентов остается внутри клеток. Хотя скорости реакций в клетке среза печени, который инкубируется (при встряхивании) в среде, лишь приблизительно имитирующей внеклеточную, могут отличаться от скоростей в норме, этот метод оказался чрезвычайно полезным из-за относительной простоты

25—1148

386

III. МЕТАБОЛИЗМ

последующих экспериментальных операций. Преимуществом работы иа этом уровне организации является возможность установления полного экспериментального контроля ие только над органом и предшествующим пищевым режимом животного, но также над составом омывающей жидкости и газовой фазой, которой эта жидкость уравновешивается. Добавка возможных предшественников в омывающую жидкость может помочь в подробном выяснении путей метаболизма.

Более низкий уровень организации представляет измельченная ткань. После разрыва клеточных мембран многие взаимосвязи, установленные между частями нормальной клетки, перестают существовать. Работа с измельченной тканью оказалась особенно результативной в исследованиях, направленных на выяснение локализации метаболических процессов внутри клетки, так как при этом становится возможным разделение многообразных структурных элементов клетки, например ядра, мембран, митохондрий и микросом (разд. 11.4.2.2), посредством дифференциального центрифугирования. Добавляя подходящие субстраты, можно установить присутствие или отсутствие той или иной ферментативной активности в этих клеточных фракциях.

Экспериментальная работа на еще более низком уровне организации включает изучение поведения ферментов в растворе. Только па основе изучения очищенного фермента возможно создание полного представления о катализируемой им реакции. Работа с очищенным ферментом позволяет исследовать его кинетические и регуляторные свойства, определить термодинамические параметры реакции и константы равновесия, а также выяснить влияние ингибиторов и активаторов.

Обобщение информации, полученной этими и другими методами, определило современный уровень понимания метаболизма.

11.4.2. Методы, используемые при изучении метаболизма

11.4.2.1. Методы исследования in vivo

Определение баланса. Измерение количества какого-либо принимаемого с пищей вещества и количества того же вещества или связанных с ним метаболитов в продуктах выделения давно используется для исследования метаболических процессов in vivo. Это позволяет подвести баланс между поступлением и выделением и сделать выводы относительно уровня и природы метаболической активности для того или иного компонента питания.

Лабораторные животные. Сама разрабатываемая проблема может подсказать наиболее целесообразный выбор вида животного для эксперимента. Важные данные для характеристики метаболизма при введении в питание того или иного вещества, имеющие отношение к метаболизму человека, получены в опытах на мышах, крысах, собаках, морских свинках, цыплятах и обезьянах. Исследования для которых необходимо много животных, обычно проводятся на мышах и крысах, которые как экспериментальный материал имеют следующие преимущества: приспособлены для размножения в лабораторных условиях, всеядны, быстро растут и развиваются; к тому же их относительно короткие времена жизни (менее трех лет) позволяют исследовать несколько поколений животных. У этих особей легко проходит инбридинг, что дает возможность получать чистые штаммы п исследовать роль генетических факторов. Исследования роста на крысах предоставили много данных, на которых базируется наука о питании (часть шестая). Однако данные, полученные на одних видах животных, могут отличаться от результатов сходных экспериментов с другими видами. Для pmvucniifl гчетеннй. наиболее приложимых к пониманию метаболизма человека, проводятся опыты на обезьянах и других приматах.

?. ОБЩИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА

387

Естественные и индуцированные нарушения метаболизма. Хирургическое удаление или серьезное повреждение органа in situ один из наиболее старых подходов к изучению метаболизма. Например, роль поджелудочной железы в этиологии сахарного диабета открыта в опытах с собакой, у которой удалили поджелудочную железу. Сведения о метаболической роли печени также получены в наблюдениях над собаками с удаленной печенью и над людьми с различными заболеваниями печени.

Некоторые метаболические расстройства названы Гарродом «врожденными сшибками метаболизма», так как они сохраняются в течение всей жизни и передаются по наследству. К врожденным ошибкам, перечисленным Гарродом в 1908 г., относились цистинурия, алкаптонурия, пентозурия и альбинизм. С тех пор у людей обнаружены сотни нарушений метаболизма, имеющих генетическую основу (гл. 27). Обследование людей с такими нарушениями — это еще один экспериментальный подход к проблемам метаболизма, особенно к выяснению его путей. При изучении наследственной природы ошибок метаболизма у микроорганизмов и других видов сделан вывод, что это следств