на на приведенном ниже модельном субстрате

Гидролизуемая связь, обозначенная стрелкой, должна находиться по соседству со свободной ?-карбоксильной группой; скорость гидролиза увеличивается, если R[ — объемистая ароматическая или алифатическая группа. Дипептнды — плохие субстраты, в то же время ?-?-ацилдипептиды оказались хорошими модельными субстратами. С-Концевой остаток должен иметь ь-конфигурацню; наличие d-аминокислоты в положении R2 значительно снижает скорость гидролиза. Сложные эфиры, подобные по структуре пептидным субстратам, также хорошо гидролизуются.

318

II. КАТАЛИЗ

Рис. 9.13. Структура карбоксипептидазы А; показаны относительные расстояния между ?-углеродными атомами и локализация функциональных групп активного центра, участвующих в связывании и катализе: атом цинка (Z), Glu-270, Туг-248, ¦Glu-72, His-69 и Arg-145. [Dickerson R. ?., Gets I., The Structure and Function of Protein, p. 90, Harper and Row., Publishers, Inc., New York, 1969.]

Карбоксипептидаза А является металлоферментом, содержащим один атом цинка; она сильно ингибируется хелатообразую-щими соединениями. Цинк можно удалить; при этом фермент оказывается неактивным, но активность его восстанавливается при добавлении цинка или некоторых других металлов. Важная роль цинка в активном центре постулировалась много лет назад; были предложены механизмы гидролиза, которые оказались в хорошем соответствии с результатами последующих рентгеноструктурных исследований фермента и комплексов фермента с ингибиторами. Данные, полученные с помощью химической модификации, свидетельствуют о том, что один из остатков тирозина фермента может участвовать в катализе.

Пространственная структура карбоксипептидазы А схематически изображена на рис. 9.13. Структура комплекса с ингибитором

9. ФЕРМЕНТЫ. II

319

Gly—Туг позволяет локализовать активный центр, который находится в неглубокой «впадине», проходящей около атома цинка и ведущей в гидрофобный «карман». Ориентация ингибитора в активном центре показана на рис. 9.14. Наиболее впечатляющим является вытеснение из активного центра при связывании субстрата по крайней мере пяти молекул воды, в том числе молекулы, связанной ранее с атомом цинка. Карбоксилатная группа субстрата связывается с гуанидиновой группой Arg-145, а фенольная гид-роксильная группа Gly—Туг находится в гидрофобном кармане. Атом цинка связан с боковыми цепями His-69, Ghi-72 н His-196. Четвертое координационное положение цинка (в отсутствие ингибитора) занято водой; ориентация трех лигандов и воды вокруг атома цинка близка к тетраэдрической. В присутствии ингибитора в субстратсвязывающем участке обнаруживается ряд структурных изменений; это указывает на вероятность реализации эффекта вынужденного контакта. Arg-145 сдвигается на ~2 А и вступает во взаимодействие с ?-карбоксильной группой ингибитора, карбоксилатная группа Glu-270 смещается на ~2 А, в направлении пептида, а Туг-248 перемещается на ~ 12 А, в результате его гид-роксидная группа оказывается около —??-группы атакуемой связи. Перемещение тирозина, по-видимому, закрывает зону активного центра, и она становится недоступной для растворителя; это обстоятельство позволяет предполагать, что увеличение скорости ферментативной реакции может отчасти быть связано с эффектом десольватацни (разд. 9.2.4). Кислород пептидной группы ингибитора приближен к атому цинка. Эти данные привели к

а

6

Рис. 9.14. Структуры активного центра карбоксипептидазы А в отсутствие (а) и в присутствии (б) Gly—L-Tyr. Связывание Gly—L-Tyr вызывает значительные перемещения Glu-270, Туг-248 и Arg-145. [Blow D. ?., Steitz ?. ?., Ann. Rew Biochem., 39, 63, 1970.]

320

II. КАТАЛИЗ

,/ \ укороченный ч q \ пептпиЭ

Рис. 9-15. Предполагаемые стадии катализируемого карбоксипептидазой А гидролиза пептида, а — связывание С-концевого фрагмента субстрата. В области активного центра может связываться несколько остатков (до шести) полипептидного субстрата, при этом образуется сложная сеть водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Атом цинка образует координационные связи с двумя остатками гистидина и одним остатком глутаминовой кислоты. В тексте обсуждены превращения, происходящие на стадиях а—г.

формулировке механизма гидролиза, показанного на рис. 9.15. Glu-270 действует как нуклеофил, образуя ангидрид с —С = 0-группой расщепляемой пептидной связи, одновременно Туг-248 атакует —??-группу гидролизуемой связи. Атом цинка выступает как электрофил, поляризующий карбонильный кислород. Далее вода поставляет протон Туг-248 и расщепляет ангидрид, восстанавливая исходную структуру активного центра; при этом освобождается второй продукт.

9.4. Заключительные замечания

Механизмы рассмотренных выше четырех ферментативных реакций могут потребовать пересмотра при получении новой инфор-

9. ФЕРМЕНТЫ. II

321

мации. В то же время эти механизмы достаточно полно учитывают основные данные, известные в настоящее время для каждого из ферментов. Хотя все четыре фермента являются гидролитическими и относительно простыми по сравнению с теми, о которых речь пойдет в последующих разделах, изложенные представления иллюстрируют основные принципы действия ферментов, включая различные механизмы, с помощью которых, как полагают, ферменты увеличивают скорости химических реакций. Кроме того, обсуждение приведенных механизмов показывает, что какой-либо один подход вряд ли позволит выяснить основы чрезвычайно высокой каталитической активности и субстратной специфичности данного фермента. Эти механизмы иллюстрируют также тонкость и сложность действия ферментов (предсказанную, вероятно, впервые Эмилем Фишером более 80 лет назад). Понимание механизма действия ферментов стало возможным (хотя и не в полной мере) только в последние два десятилетия благодаря разработке весьма совершенных методов исследования и формулировке новых биохимических принципов.

ЛИТЕРАТУРА

Книги

Bernhard S., The Structure and Function of Enzymes, W. A. Benjamin, Inc., New York, 1968.

Boyer P. D., ed., The Enzymes, 3d ed., Academic Press, Inc., New York, 1970.

Bray H. G., White K-, Kinetics and Thermodynamics in Biochemistry, 2d ed., Academic Press, Inc., New York, 1967.

Bruice Т. C., Benkovic S., Bioorganic Mechanisms, vols. I, II, W. A. Benjamin, Inc., New York, 1966.

Colowick S. P., Kaplan N. O., eds., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., New York. (Публикация этой серии начата в 1958 г. и продолжается в настоящее время.)

Desnuelle P., Neurath ?., Ottesen ?., eds., Structure-Function Relationships of

Proteolytic Enzymes, Academic Press, Inc., New York, 1970. Enzyme Models and Enzyme Structure, Brookhaven Symp. Biol., 15, Brookhaven

National Laboratory, Brookhaven, N. Y., 1962. Florkin M., Stotz ?. H., eds., Comprehensive Biochemistry, sec. Ill, vols. 12—16,

Biochemical Reaction Mechanisms, Elsevier Publishing Company, Amsterdam,

distributed by American Elsevier Publishing Company, Inc., New York, 1964—

1966.

Gutfreund H., Enzymes: Physical Principles, Wiley-Interscience, New York, 1972.

International Union of Biochemistry, Enzyme Nomenclature, American Elsevier Publishing Company, Inc., New York, 1973.

Jencks W. P., Catalvsis in Chemistry and Enzvmology, McGraw-Hill Book Company, New York, 1969.

КШг I. M., Energy Changes in Biochemical Reactions, Academic Press, Inc., New York, 1967.

Meisler ?., ed., Advances in Enzymology, Interscience Publishers, division of John Wiley & Sons. Inc., New York. (Этот ежегодник публикуется начиная с 1941 г. и содержит много обзорных статей.)

21—1148

322

П. КАТАЛИЗ

Segal I. ?., Enzyme Kinetics, Wiley-Inlerscience, New York, 1975.

Structure and Function of Proteins at the Three-Dimensional Level, Cold Spring

Harbor Symp. Quant. Biol., vol. 36. Cold Spring Harbor. New York, 1972. Webb J. L., Enzyme and Metabolic Inhibitors, vols. I—III. Academic Press. Inc..

New York, 1963—1966.

Обзорные статьи

Atkinson D. E., Regulation of Enzyme Action, Annu. Rev. Biochem.. 35, 81—124, 1966.

Eigen M., Hammes G., Elementary Steps in Enzyme Reactions. Adv. Enzymol, 25, 1—38, 1963.

Bruice Т. C, Some Pertinent Aspects of Mechanism as Determined with Small Molecules, Annu. Rev. Biochem., 45, 331—373, 1976.

Gutfreund H., Transient and Relaxation Kinetics of Enzyme Reactions, Annu. Rev. Biochem., 40, 315—344, 1971.

Gutfreund H., Knowles J. R., The Foundations of Enzyme Action, pp. 25—72 in: P. N. Campbell, G. D. Greville, eds., Essays in Biochemistry, vol. 3, Academic Press, Inc., New York, 1967.

Hess G. P., Rupley J. ?., Structure and Function of Proteins, Annu. Rev. Biochem., 40, 1013—1044, 1971.

Holzer H., Duntze W., Metabolic Regulation by Chemical Modification of Enzymes,

Annu. Rev. Biochem., 40, 345—374, 1971. Jencks W. P., Binding Energy, Specificity and Enzyme Catalysis: The Circe Effect,

Adv. Enzymol., 43, 219—410, 1975. Kirsch J. F., Mechanism of Enzyme Action, Annu. Rev. Biochem., 42, 205 234.

1973.

Liljas ?., Rossman M. G., X-ray Studies of Protein Interactions. Annu. Rev. Biochem., 43, 475—507, 1974.

Koshland D. E., Jr., Neet К. E., The Catalytic and Regulatory Properties of Enzymes, Annu. Rev. Biochem., 37, 359—410, 1968.

Monod J., Wyman J., Changeux J. P., Cn the Nature of Allosteric Transitions: A Plausible Model, J. Mol. Biol., 12, 88—118, 1965.

Phillips D. C., The Three-dimensional Structure of an Enzvme Molecule, Sci. Am., 215. 78—90, November 1966.

Quiocho F. ?., Lipscomb W. N., Carboxypeptidase A: A Protein and an Enzyme, Adv. Protein Chem., 25, 1—78, 1971.

Rose I. ?., Mechanism of Enzyme Action, Annu. Rev. Biochem., 35, 23—56, 1966.

Sigman D. S., Mooser G., Chemical Studies of Enzyme Active Sites, Annu. Rev. Biochem., 44, 889—931, 1975.

ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ

МЕТАБОЛИЗМ

Глава 10

ПРИНЦИПЫ БИОЭНЕРГЕТИКИ

Термодинамические аспекты. Окислительно-восстановительные реакции. Высокоэнергетические фосфаты

Процессы окисления в живой клетке имеют два основных назначения: обеспечить энергией все нуждающиеся в ней формы жизнедеятельности и прев