пу-риновые и пиримидиновые кольца — в плотном контакте с соответствующими связывающими участками, а ?-??, Lys-41, так же как His-12 и His-119, — около отрицательно заряженного фосфата, б — в результате согласованного действия His-12, выступающего как основание, акцептирующее протон от 2'-ОН-группы рибозы, и His-119, выступающего как кислота и образующего водородную связь с атомом О фосфата, образуется промежуточный комплекс, в котором фосфор находится в пентакоординационном состоянии (тригональная бипирамида). в — образование циклического-2',3'-фосфорибозного интермедиата сопровождается уходом протона от His-119 (His-12 уже присоединил протон), г — в активный центр вступает молекула воды, поставляющая протон His-119 и гидроксидную группу фосфату, д — образуется тригональная бипирамида, которая претерпевает перегруппировку при участии His-12, поставляющего протон, е— образуется продукт — пиримидинрибозо-З'-фосфат. [Roberts G. С. К-, Dennis ?. ?., Meadows D. ?., Cohen J. S., Jardesky O., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. ?., 62, 1151,

1969.]

9. ФЕРМЕНТЫ. II

313

модификации, рассматриваются как функциональные группы активного центра. Рентгеноструктурные исследования комплексов РНазы с различными ингибиторами показали, что все они, как можно было ожидать, связываются в одном и том же участке вблизи двух остатков гистидина. Ориентация в активном центре одного из ингибиторов UpA, у которого атом кислорода между фосфором и 5'-СН2-группой рибозы аденина (А) заменен метилено-вой группой (ирСНгА), показана на рис. 9.9. Ориентация ингибитора в активном центре, вероятно, несколько отличается от таковой для субстрата; однако, как видно на рис. 9.9, His-12 и His-119 располагаются вблизи гидролизуемой фосфоэфирной связи. Пи-римидиновое и пуриновое кольца локализуются в специфических областях. Пиримидиновое кольцо образует водородные связи с ОН-группой боковой цепи Thr-45 и ??-группой его пептидной связи. По одну сторону от пиримидинового кольца располагается Phe-120, а по другую Val-43. Поскольку эти остатки образуют углубление, в котором связывается пиримидиновое кольцо, то можно понять, почему происходит инактивация РНазы при отщеплении пепсином С-концевого фрагмента, содержащего остатки с 120-го по 124-й.

На основании данных, полученных с помощью рентгенострук-турного анализа и при исследовании свойств РНазы в растворе, предложено несколько схем механизма действия этого фермента; одна из них приведена на рис. 9.10. Данная схема не может считаться однозначно доказанной; однако ясно, что в случае катализа РНазой увеличение скорости реакции обусловлено специфическим связыванием различных групп субстрата соответствующими участками активного центра и, вероятно, согласованным действием His-12 и His-119, осуществляющим общий кислотно-основной катализ.

9.3.3. Лизоцим

Хорошие субстраты лизоцима — полисахариды клеточных стенок бактерий, повторяющейся единицей которых является дисаха-рид, состоящий из ?-ацетилглюкозамина и ?-ацетилмурамовой кислоты, связанных между собой р-1,4-связью (гл. 15). Более простым субстратом является гексамер ?-ацетилглюкозамина — гек-ca-N-ацетилхитогексаоза, в котором гидролизуется одна гликозид-ная связь и при этом образуются тетра- и дисахарнд.

3 сн2он 0 сн2он 0 снгон 0 сн2он Q скон Q ^Ja^OI-O

он

А

в

с

D

?

F

гекса-М-эцетпилхиптогЕКсаоза

314

II. КАТАЛИЗ

Структура лизоцима из белка куриных яиц, содержащего 129 остатков, схематически изображена на рис. 9.11. Исследование структуры комплексов фермента с моно-, ди- и трисахарндами показало, что связывание Сахаров происходит в «щели», находящейся между двумя половинами молекулы. ????-?-ацетилхитотриоза располагается при этом таким образом, что ее невосстанавлива-ющий конец (сахар А) оказывается у начала щели, а восстанавливающий конец (сахар С) — в центральной ее части. Установлено, что при связывании субстрата происходит небольшое перемещение (~0,75 А) некоторых боковых групп внутри щели; это указывает на осуществление взаимодействия по типу «вынужденного контакта». На модели фермента внутри щели были размещены еще три остатка сахара, причем каждый последующий сахар «присоединялся» таким образом, чтобы его конформация была (насколько это возможно) такой же, как у первых трех остатков. Все остатки сахара (за исключением одного из шести) реализуют эффективные нековалентные взаимодействия с R-группами и пептидными группами (рис. 9.11); образуется много водородных связей и осуществляются неполярные контакты. Поскольку гидролиз происходит между четвертым и пятым остатками Сахаров (D и Е), особенно важно проанализировать окружение расщепляемой гликозидной связи. По одну сторону от связи на расстоянии ~3 А (от атома О) находится карбоксильная группа Glu-35, а по другую — расположена карбоксильная группа Asp-52. Поскольку Glu-35 находится в гидрофобном окружении, ее карбоксильная группа, вероятно, протонирована; Asp-52 участвует в образовании сложной сети водородных связей между гидрофильными группами, и ее карбоксильная группа, по-видимому, ионизирована. Поскольку эти карбоксильные группы являются ближайшими к атакуемой гликозидной связи, предполагается, что они участвуют в каталитическом процессе. Далее, если сахарный остаток D поместить в субстратной щели, сохраняя для него нормальную конформацию кресла, в которой, как предполагается, находятся все остальные остатки Сахаров, то этот остаток должен был бы оказаться в слишком тесном контакте с группами, расположенными в щели. Если, однако, допустить, что этот остаток находится в напряженной конформации полукресла, то оказывается, что расстояния до соседних групп соответствуют нормальным, которые необходимы для контактов. Поэтому полагают, что при связывании субстрата остаток D находится в напряженном состоянии; при этом энергия, необходимая для поддержания остатка в невыгодной конформации полукресла, более чем компенсируется энергией связывания других остатков Сахаров.

На основании рассмотренных выше представлений предложен механизм гидролиза гексасахарида (рис. 9.12). При связывании ферментом гексасахарида конформация сахарного остатка D ока-

9. ФЕРМЕНТЫ. II

315

Рис. 9.11. Структура комплекса лизоцима яичного белка с субстратом — гекса-?-ацетилхитогексаозой. Показаны только R-группы, выстилающие зону активного центра п образующие большое число нековалентных взаимодействий с субстратом. А—F — остатки сахара (А — невосстанавливающий конец, F — восстанавливающий конец). Гидролиз происходит по гликозидной связи между D и Е. Как описано в тексте, Asp-52 и Glu-35, находящиеся по обе стороны от места расщепления субстрата, участвуют в катализе. [Dickerson R. ?., Gets J., Structure and Function of Protein, p. 71, Harper and Row, Publishers, New York, 1969.]

316

II. КАТАЛИЗ

6 6

Рис. 9.12. Предполагаемый механизм действия лизоцима; гидролизу субстрата способствует специфическое связывание в активном центре остатков сахара А—Е. Показаны только остаток D и часть остатка Е. При связывании (а) субстрат оказывается в непосредственной близости от Asp-52 и Glu-35; последние участвуют в расщеплении D—? гликозидной связи. Образующийся при этом интермедиат (б) реагирует с ОН- и Н+ (из воды), в результате чего образуется продукт и происходит возвращение фермента в исходное состояние (в). [Dickerson R. ?., Geis ]., Structure and Function of Protein, p. 77, Harper and Row, Publishers, Inc.,

New York, 1969.]

зывается напряженной. Glu-35 выступает донором протона для кислорода гликозидной связи между остатками Сахаров D и Е, что приводит к разрыву связи и образованию дисахарида (остатки ? и F), удаляющегося из комплекса, и тетрасахарида, в состав которого входят остатки от А до D. При разрыве гликозидной связи остаток сахара D принимает форму карбониевого иона (С+) и конформацию полукресла. Стабилизации карбониевого иона способствуют отрицательный заряд на Asp-52 и напряженное состояние остатка D. Известно, что распределение положительного заряда между углеродом и кислородом пиранозного кольца стабилизирует карбониевые ионы Сахаров в конформации полукресла. Далее ОН-группа воды присоединяется к атому С-1 карбониевого иона сахарного остатка D, а протон воды — к Ghi-35; таким образом, реакция завершается.

В этом механизме увеличение скорости реакции достигается в результате совокупного действия ряда факторов: энергии специфического связывания субстрата, напряжения кольца сахара, эффекта вынужденного контакта; при этом Glu-35 выступает как общий кислотный катализатор, a Asp-52 способствует стабилизации карбониевого иона на промежуточной стадии реакции. Рассматриваемый механизм получил существенное подтверждение в дальнейших исследованиях ферментативной реакции. Во-первых, при определении энергии связывания каждого сахара оказалось, что энергетически невыгодным является связывание только одного остатка, именно сахара D, что согласуется с предположением о его

Э. ФЕРМЕНТЫ. II

317

напряженной конформации (полукресло). Во-вторых, оказалось возможным в присутствии субстрата химически модифицировать все карбоксильные группы лизоцима, за исключением Asp-52 и Glu-35, сохраняя при этом активность; в отсутствие субстрата модифицируется также Asp-52 (но не Glu-35), однако активность полностью теряется. В-третьих, мощным ингибитором фермента является аналог переходного состояния, имеющий следующую структуру:

HNAc HN Ac HN Ac HNAc

лакглон mempa-N-ацегпилхитотегпраоэы

Сахар D ингибитора — лактон (для лактона конформации полукресла является нормальной); таким образом, этот тетрасахарид имеет такую же структуру, как остатки А—D субстрата при связывании с ферментом, и хорошо вписывается в субстратную щель; при этом энергия связывания оказывается благоприятной. В-четвертых, оптимум активности лизоцима находится при рН 5; по обе стороны от оптимума активность, как и следовало ожидать, понижается; если при более высоком рН происходит депротони-рование Glu-35, то при более низком рН — протонирование Asp-52.

9.3.4. Карбоксипептидаза А

Субстратная специфичность этого фермента проиллюстрирова