иментальных подходов с целью выяснения структурно-функциональных особенностей ферментов. Для каждого из этих ферментов установлена первичная структура, выяснена структура активного центра и механизм связывания субстрата. Кроме того, детально изучены каталитические свойства этих ферментов, и на основе полученных данных предсказан вероятный механизм действия каждого нз них.

9.3.1. Химотрипсин

k Лучшие субстраты и ингибиторы химотрипснна содержат ароматические или объемистые алифатические R-группы (табл. 6.3); это указывает на участие гидрофобных сил в образовании фермент-субстратного комплекса. Например, ?-?-ацетнлпроизводные ь-тирозинамида и l-фенилаланинамида являются значительно лучшими субстратами, чем соответствующий амид ь-аланина. Кинетические исследования (разд. 9.2.6) указывают также на образование ковалентного промежуточного соединения. Зависимость от рН константы скорости k2 (разд. 9.2.6) позволяет предполагать, что в реакции ацилирования участвует группа с р/С, близким к ? К нмндазольной группы боковой цепи гистидина.

Химическая модификация специфическими реагентами указывает на функционирование в активном центре остатков серина и

9. ФЕРМЕНТЫ. II

299

гистидина. Ряд фторфосфатов инактивирует фермент; например, диизопропилфторфосфат (ДИФФ) стехиометрически реагирует с ферментом, образуя диизопропилфосфорилхимотрипсин (ДИФ-химотрипсин):

° гн О

У 3 II

Е—ОН + F-P—О—СН -> ?-О-Р—О-СН + F~ + Н+

0 СНз О ЧсНз

1 Г

СН

СН, СН, СН ^?3

Зиизопропилфгпорфосфат ДИФ-химотрипсин

ДИФ-химотрипсин совершенно не активен. Поскольку из 28 остатков серина с реагентом взаимодействует только один остаток (серин-195), а утративший активность в результате тепловой денатурации хнмотрипсин вообще не модифицируется реагентом, сделано заключение, что серин-195 находится в активном центре. Все так называемые сериновые протеиназы (табл. 6.4), образующие промежуточные ковалентные соединения (ацилферменты), также реагируют с ДИФФ; анализ последовательности аминокислот в инактивированных с помощью ДИФФ ферментах показал, что остаток реактивного серина находится во фрагменте, имеющем у всех этих ферментов идентичную (или очень сходную) последовательность. Одна и та же последовательность Gly—Asp— Ser-?—Gly—Gly—Pro имеется в химотрипсине, трипсине, эласта-зе, тромбине и плазмине, однако у субтилизина последовательность аминокислот, включающая реактивный остаток серина, другая. Высокая реакционная способность модифицируемых остатков серина является следствием их уникального окружения в активных центрах соответствующих ферментов.

При действии на химотрипсин г-1-(л-толуолсульфонил)амидо-2-фенилэтилхлорметилкетоном (ТФХК) также наблюдается включение ковалентно связывающегося ингибитора (параллельно происходит снижение активности)

? л

^=л^ О (СН2)4 о

1-С-С-СН2-С1 н3с-/ VS-NH-C-С-СН2-С1

н — О Й

1-1-(л-толуол-сульфонил) вмиЭо 2- L-5-амино- 1-(п-толуолсульфоннп)-

фенилэтилхлорметшгкетон амиЗопентилхлорметилкеплон

300

II. КАТ\ЛИЗ

Структура ТФХК отвечает требованиям, предъявляемым к хорошему субстрату, и напоминает амид или эфир ацетилфенилала-нина, у которых —??2 или —ОСН3 заменены негндролнзуемой группой —СН2—С1. Энергия связывания ТФХК (его сродство к активному центру) примерно такая же, как ? субстрата, однако

I

вследствие высокой реакционноспособности группы 0 = С—СН2С1 реагирует с нуклеофилом в активном центре. Структурные исследования показывают, что ТФХК реагирует с азотом, находящимся в положении 3 имидазольного кольца гистидина-57:

Е-СН,

/1

\

О II

+ R—С—СН2

-С1

-СН.,

-??

?—

° + а- + №

N—СН,—С—R

где Р=1-(«-толуолсульфонил)амидо-2-феннлэтил. У химотрипснна

(а также у трипсина, тромбина и эластазы) His-57 находится в

последовательности Ala—Ala—His—Cys.

На избирательную специфичность ТФХК к химотрипсину указывает тот факт, что ингибитор не реагирует с другой сериновой

протеиназой — трипсином, однако трипсин реагирует со сходным ингибитором L-5-aMiiHo-l- (л-толуолсульфонил) амидопентилхлор-метплкетоном (ТАХК), в структуре которого имеется боковая цепь —(СН2)4—МНз, необходимая для продуктивного связывания -с активным центром трипсина. ТАХК модифицирует специфический остаток гистидина в трипсине, но не инактивирует химотрипсин. Обработка фермента ТФХ1\ или ТАХК является примером аффинной модификации активного центра, а сами ингибиторы — аффинными метками, или, образно говоря, ингибиторами типа «троянского коня». Аффинные метки известны также для ряда других ферментов; они особенно полезны для идентификации остатков, находящихся в активном центре.

Известна последовательность (рис. 9.2) и пространственная структура ?-химотрипсина и его зимогена — химотрипснногена; частично сформированный в зимогене активный центр, не способный осуществлять катализ, полностью сформирован в химотрип-сине, образующемся при активации зимогена (разд. 8.7.2.1). На рис. 9.3 изображена конформация пептидной цепи фермента; показано расположение групп активного центра. Остатки Ser-195 и His-57 сближены, что согласуется с более ранними данными по химической модификации групп активного центра. Данные реитгеноструктурного анализа свидетельствуют также об участии ряда других функциональных групп в формировании активного центра. ?-Концевой изолейции В-цепи, который не является концевым в одиночной полипептидной цепи неактивного зимогена и освобож-

9. ФЕРМЕНТЫ. II

301

В-цепь

Рис. 9.2. Аминокислотная последовательность ?-химотрипсина. Затемненные остатки входят в число тех, которые сближены в нативном ферменте, образуя активный центр. [Blow D. ?., p. 185, in: P. Boyer ed., The Enzymes, vol. Ill, Academic Press., One, New York, 1971.]

дается в результате активации, приводящей к образованию активного фермента, оказывается сближенным с Asp-194. Как показано на рис. 9.4, ?-аминогруппа Не-16 образует ионную пару с карбок-силатной группой боковой цепи Asp-194. Гидроксидная группа Ser-195 расположена на расстоянии ~3 А от атома азота, находящегося в положении 3 имидазольного кольца His-57. Расстояние между гидроксидной группой серина и атомом азота имидазола и

302

II. КАТАЛИЗ

геометрия их взаимного расположения позволяют образоваться между ними водородной связи. Далее, атом азота в положении 1 имидазольного кольца находится на расстоянии ~2,8 А от атома кислорода карбоксилатной группы боковой цепи Asp-102; в этом случае геометрия взаиморасположения также благоприятна для образования водородной связи. Наконец, водородная связь образуется между одним из атомов карбоксилатной группы Asp-102 и —??-группой пептидной связи, находящейся между His-57 и А1а-56. Три рассматриваемые остатка Asp-194, Ser-195 и Asp-102 образуют систему переноса заряда, которая, как полагают, с одной стороны, позволяет His-57 функционировать в качестве сильного кислотно-основного катализатора, а с другой стороны, способствуя оттягиванию протона от —ОН-группы Ser-195, увеличивает ее ре-акционноспособность.

Сравнение кристаллических структур ?-химотрипсина в присутствии и в отсутствие ?-формилтриптофана (который называют виртуальным субстратом, поскольку кислород его карбоксильной группы обменивается с кислородом воды в присутствии химотрип-

Рис. 9.3. Конформация пептидных цепей ?-химотрипсина (а) и эластазы (б). Перегибы цепи соответствуют положениям ?-углеродных атомов; R-группы не показаны. [Hartley В. S.. Shotlen D. ?., p. 323. in: P. Boyer, ed., The Enzymes, vol. Ill, Academic Press, Inc., New York, 1971.]

9. ФЕРМЕНТЫ. II

303

Ос

Gly-193

¦ ON

гиброксиЭ-ная группа-^

имиЭазольное кольцо

Ие-16

Рис. 9.4. Система переноса заряда в активном центре химотрипсина (по данным рентгеноструктурного анализа). [Blow D. ?., p. 185, in: P. Boyer, ed., The Enzymes, vol. Ill, Academic Press, One, New York, 1971.]

сина) раскрывает некоторые дополнительные детали строения активного центра.

Как показано на рис. 9.5, ?-формилтриптофан внедряется в «полость» активного центра и располагается очень близко от системы переноса заряда, с которой контактирует его карбоксильная группа. Индольная группа направлена в противоположную сторону, ее плоское кольцо располагается почти параллельно полипептидной цепи, проходящей вдоль обоих сторон кольца, и имеет гидрофобные контакты с некоторыми R-группами, в первую очередь с R-группой остатка Met-192. Амидная группа формил-триптофана направлена в сторону —СО-группы пептидной связи, образованной остатком Ser-214. Рассмотренные нековалентные взаимодействия, обеспечивают связывание субстрата, определяют специфичность химотрипсина и вносят вклад в увеличение скорости катализируемой реакции.

О

HN—СН

?

Ot-N -формил-Ь-гприпгпофан

304

II. КАТАЛИЗ

Рис. 9.5. Структуры активных центров ?-химотрипсииа (сверху) и эластазы (снизу), основанные иа данных кристаллографического анализа; показано расположение виртуальных субстратов ?-формилтриптофана (для ?-химотрипсина) и ?-???-милалаинна (для эластазы). [Hartley В. S., Shotten D. ?., p. 323, in: P. Boyer, ed., The Enzymes, vol. Ill, Academic Press, One, New York, 1971.]

9. ФЕРМЕНТЫ. II

305

Вероятный механизм функционирования химотрипсина, основывающийся на приведенных выше данных, показан на рнс. 9.6. Очевидно, что для решения вопроса, справедлив ли этот механизм, необходимы дальнейшие исследования. Однако этот механизм достаточно хорошо согласуется со всей доступной в настоящее время информацией.

В заключение следует отметить, что другие сериновые протеи-назы, такие, как плазмин, эластаза, тромбин и трипсин, функционируют, по-видимому, по такому же механизму; эти протеин азы отличаются от химотрипсина некоторыми деталями структуры, которые, в частности, определяют различия в субстратной специфичности. Например, аминокислотная последовательность и конфор-мация эластазы и химотрипсина очень сходны (рис. 9.3); эластаза также имеет систему переноса заряда, образованную такими же, как в химотрипсине, аминокислотными остатками. Особенности субстратной специфичности обнаруживаются в различном характе