?.

??2+ ?? О

II I II

H2N—С—NH—(CH2)4—CH—С—NH2

ос-бензои л - L- орнитинамиЭ

оГ-бензоил-Ь-гомоаргининамиЭ

Другие ферменты могут реагировать с различными соединениями и имеют, следовательно, относительно широкую субстрат-

9. ФЕРМЕНТЫ. II

283

ную специфичность. Примером является лейцинаминопептидаза, которая с различными скоростями гидролизует амиды многих аминокислот и дипептиды (табл. 9.1). Лейцинаминопептидаза катализирует реакцию

??2 О

?"

?

-С—NHR' + ?,? + Н+

??,*-

I 3

R—С—СОО- + +H3NR*

I 3

?

где R — боковая цепь аминокислоты, а Р/ — либо атом ? (в амидах), либо другая аминокислота (в дипептидах). Субстрат должен иметь незамещенную аминогруппу и атом водорода у ?-углерода, соседнего с атакуемой пептидной или амидной связью; ?-концевой остаток должен иметь l-конфигурацию [за исключением глицина, производные которого являются, однако, плохими субстратами (см. табл. 9.1)].

Таблица 9.1

Относительные скорости гидролиза различных субстратов лейцинаминопептидазой

Субстрат Относительная скорость Субстрат Относительная скорость

L-Лейцинамид 100 и-Лейнил-С-ленцин 100

L -Фенилаланинамид 26 L-Лейцил- L.-изоленцин 64

Ц-Изолейцинамид 20 L -Л ейцил-Ь-аланин 64

Ц-Гистидинамид 19 Ь-Лейцил-Ь-фенилаланин 26

L-Лизинамид 7,1 1..-Аланил-1--лейцин 93

L-Алаиинамид 3,4 L -Аланилглицин 9,4

L-Аспарагиновой кислоты 2,9 Глицил-L -лейцин 10

диамид Глнцилглицин 1,1

L-Серинамид 0,8 D-Лейцилглицин 0

L.-Пролинамид 0,7 Ацетил-Ь-тирозипамид 0

Глицинамид 0,1 а-Бензоил-ь-аргининамид 0

D-Лейцинамид 0

?-Аланинамид 0

Скорость для лейцинамида условно принята за 100, для остальных субстратов приведены относительные скорости. Фермент выделен из почек свиньи; определения проведены с ферментом, активированным Мп-+ при рН 8,0—8.5. \Delange R. /., Smith ?. ?., p. 81, in: P. Boyer. ed.. Enzymes, vol. Ill, Academic Press. Inc. 1971.]

Рассмотренные выше примеры иллюстрируют ряд аспектов субстратной специфичности ферментов. При взаимодействии суб-

284

II. КАТАЛИЗ

страта и активного центра имеет место пространственная, или стерическая, специфичность. Это положение было сформулировано в 1935 г. Бергманом и сотр., которые, объясняя способность лейцинаминопептидазы гидролнзовать L-лейцилглицин, но не d-лейцилглицин (табл. 9.1), убедительно полагали, что взаимодействие фермента с субстратом должно осуществляться по крайней мере в трех точках. Это поясняется на приводимой ниже схеме:

СО—??—СН2—СОО

Ь {+?3?—С—? Ъ {н—С—NH/

СН2 СН2

I I

,сн СН

.СНз СН;, СН3 ХСН3

L- лейцилглицин D- лейцилглицин

Если а, Ъ и с — участки активного центра фермента, комплементарные указанным группам l-лейцилглицнна, и если приведенная пространственная ориентация необходима для связывания и последующего катализа, то очевидно, что невозможно ориентировать в пространстве те же самые три группы d-лейцилглнцина, чтобы они взаимодействовали с участками а, Ь и с. Эта концепция полиаффинности была подтверждена относительно недавно кристаллографическим анализом фермент-ингибиторных комплексов; ее иллюстрацией может служить также стереоспецифичность трипсина и фумаразы. Скорость превращения субстрата зависит от размера и строения групп субстрата; об этом свидетельствуют не только неспособность соединений, содержащих d-аминокислоты, служить субстратами лейцинаминопептидазы, но также и различие в скоростях гидролиза амидов лейцина и изолейцина. Столь же впечатляющей является неспособность трипсина гидролнзовать ?-?-бензоилпроизводные ь-орнитинамида и ь-гомоаргинин-амида.

Связывание субстратов с комплементарными участками активного центра осуществляется за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий и водородных связей; однако некоторые ферменты образуют ковалентные интермедиа™ (такие примеры встречаются далее). Скорость гидролиза амидов (табл. 9.1) лей-цинаминопептидазой зависит от природы R-группы: она увеличивается в последовательности Н<СНз<С2Н5<СзН7<С4Нд. Наличие в R-группе полярных или ионных структур, таких, как ·—СОО-, —NH3 , —CONH2 и —СН2ОН, снижает скорость гидролиза. Основываясь на этом, можно предположить, что между R-группой суб-

9. ФЕРМЕНТЫ. II

28&»

страта и комплементарной гидрофобной областью активного центра осуществляется гидрофобное взаимодействие. Такие представления подтверждаются данными о том, что алифатические спирты являются ингибиторами фермента (по-видимому, в результате конкуренции с R-группами субстрата за взаимодействие с гидрофобной зоной активного центра). В связывании субстратов участвуют также и электростатические взаимодействия; на это, в частности, указывают данные о том, что эфиры фумарата и малата не являются субстратами фумаразы. Другой пример — неспособность сукцинатдегидрогеназы действовать на замещенный по одной из карбоксильных групп сукцинат или фумарат (например, на монометиловый эфир сукцината). Это находится в согласии с данными о том, что конкурентные ингибиторы дегидрогеназы содержат по крайней мере одну карбоксилатную группу и что наиболее эффективными ингибиторами являются соединения с двумя незамещенными карбоксилатными группами (разд. 8.5.1). Положительный заряд на ?-аминогруппе лизина или гуанидиновой группе аргинина необходим для субстратов трипсина; кристаллографические исследования показывают, что R-группы субстрата локализуются в активном центре таким образом, что катионные амино-и гуанидиновая группы оказываются в непосредственной близости от анионной карбоксилатной группы боковой цепи остатка ас-парагиновой кислоты фермента. Наиболее убедительные свидетельства множественности взаимодействий, осуществляемых между ферментом и субстратом, получены при сравнении структур ферментов и их комплексов с ингибиторами (по данным кристаллографических исследований); эти данные обсуждаются ниже к этой главе.

9.2. Механизмы увеличения скоростей катализируемых ферментами реакций

Один из главных вопросов биохимии заключается в следующем, каким образом ферменты ускоряют химическую реакцию? Многие факторы ответственны за такое ускорение, которое, как обсуждалось выше (разд. 8.1.6), является в конечном счете результатом, снижения энергии активации катализируемых реакций.

9.2.1. Увеличение скорости и субстратная специфичность

Для различных типов химических реакций, катализируемых ферментами, известны аналогичные реакции в органической химии. Однако уникальным свойством ферментов является их субстратная специфичность. Характер действия многих ферментов

286

II. КАТАЛИЗ

указывает на то, что специфическая энергия многоточечного связывания, осуществляемого между комплементарными группами субстрата и активного центра, используется в качестве движущей силы катализа и вносит значительный вклад в снижение энергии активации процесса, т. е. приводит к значительному его ускорению. Значение специфичности отчетливо проявляется при сравнении скоростей гидролиза ряда субстратов лейцинаминопептида-•зой (табл. 9.1). Эффективность гидролиза субстрата зависит в первую очередь от гидрофобности R-группы ?-концевой аминокислоты, которая участвует в образовании атакуемой амидной или пептидной связи.

Другим примером может служить действие фосфоглюкомутазы {гл. 15), которая катализирует обратимую реакцию

GC-D-r.TK>K030-l -фосфат < > «-D-глюкозо-б-фосфат

Эта реакция протекает только в присутствии Mg2+ и глюко-.30-1,6-дифосфата; в ходе реакции образуется промежуточное соединение— фосфорилфермент, фосфатная группа которого (связанная с определенным остатком серина в молекуле фермента) обменивается с фосфатными остатками субстрата н глюкозо-1,6-дифосфата:

?—ОН -f- глюкозо-1,6-дифосфат < * ?—О—Р0|_ + глюкозо-1 (или 6)-фо;фаг

В результате этой реакции происходит взаимопревращение фосфатных эфиров. Фосфорилфермент стабилен в водных растворах, но реагирует с различными соединениями типа ROH (табл. 9.2) согласно реакции

?—О—Р0|- + ЕОН -> Е—ОН + ROPO|-

Сравнение скоростей фосфорилирования различных субстратов позволило выяснить ряд интересных аспектов, характеризующих связывание субстрата и каталитическую эффективность. Перенос •фосфорильной группы с фермента на воду (гидролиз фосфорнлфермента) протекает очень медленно, со скоростью лишь в ~60 раз большей, чем скорость неферментативного гидролиза серии-фосфата. В то же время фосфит и- ксилозо-1-фосфат, не являющиеся субстратами, ускоряют перенос фосфата фосфорнлфермента на воду в 580 и 1,7-105 раз соответственно. Это показывает, что реакционноспособность фосфорильной группы фосфорнлфермента значительно увеличивается в присутствии соединений, структурно сходных с субстратами и способных, следовательно, связываться ¦с активным центром (фосфит связывается на участке фосфата, .а ксилоза — на участке сахара). Ксилоза фосфорилируется фосфо-рилферментом значительно быстрее, чем вода; в присутствии же фосфита она фосфорилируется с образованием кснлозо-1-фосфата в 2-109 раз быстрее, чем вода.; наблюдаемая скорость лишь в

9. ФЕРМЕНТЫ. 11

287

Таблица 9.2

Относительные скорости фосфорилирования ряда соединений фосфорилферментом (фосфоглюкомутазой )а

Субстрат НОН

О тпноси тельная скорость"

Субстрат ROH

Отпиоситп е льная скорость ?

нон нон

( » )

фосфит

нон

oC-D- ксилозо-1-фосфат

у?" чА

он] ? он н он

D-нсилоза ?

J40H ну[ (+-0-Р-0-)

HO\j l/??

oh

D-ксилоза

1,7 ¦ ??5

7 · ??4

2 ¦ 10s

??? ???,--

CH, сн,

Yh,—сн,

НО. СН=СН ОРО,2-

хсн, сн,

НОч СН СН,ОРО,г-

сн, сн

ноч ???,2

сн, с=с—сн/

но

ОГО/

сн,—сн,—О—сн

сн.,—он

СН.ОН

-оч

?

он н

н он

ос- D- глюко зо - 1-фо ссрат

2 ¦ 105

4,4 ¦ 105 1,4 . 106 4,4 ¦ 10г

9 - 10*

3 . 10""

а Скорость фосфорилирования воды условно принята равной единице, для остальных соединений приведены относительные скорости. Константа скорости первого порядка фосфорилирования воды фосфорилферментом при 30 °С и рН 7.5 равна 3.2-10-* с—1. \/encks W. Ft.. Adv. Enzymol.,43, 219, 1975.]

15 раз меньше скорости фосфор