Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

ь). Обратите внимание иа то, что при пн=\ на рис. а наблюдается сигмондная зависимость. IKoshland D., р. 352, in Р. Воуег, ed., The Enzymes, vol. I, 3d ed., Academic Press.

Inc., New York, 1970.]

для их обратных величин оказываются нелинейными. Кинетика их действия описывается уравнением, подобным уравнению (9); сделав некоторые преобразования этого уравнения, получаем

К = fS)a» V™* ~ V (36)

272

II. КАТАЛИЗ

или в логарифмической форме

te ? V~V =^U[S]-lg/C (37)

где пн — единственный параметр, которым уравнения (36) и (37) отличаются от уравнения (9); это коэффициент Хилла, впервые введенный при описании нелинейных кривых насыщения гемоглобина кислородом (гл. 31). Численное значение пн не может превышать пт — максимального числа лигандов (эффекторов или субстратов), которое может связать белок (обычно оно равно числу субъединиц аллостерического фермента). Зависимость IgiWC^max—V)} от lg[S] является прямой с наклоном пн (рис. 8.10). пн отражает характер аллостерических свойств фермента в присутствии эффекторов. Как схематически показано на рис. 8.9, при связывании эффектора или субстрата с одним из аллостерических центров происходит изменение конформации соседней субъединицы, приводящее к активации субстратного центра этой субъединицы; это изменение конформации является показателем кооперативного взаимодействия между каталитическими центрами фермента.

Положительная кооперативность характеризуется пн>1, т. е. связывание первой молекулы субстрата или эффектора усиливает связывание второй молекулы субстрата и наблюдается ускорение реакции. Это обстоятельство отражает график зависимости V от [S] для пируваткиназы (рис. 8.11); положительными эффекторами фермента являются фосфоенолпируват (PEP) и фруктозо-1,6-дифосфат (FDP). График зависимости V от [PEP] представляет собой гиперболу, в то время как соответствующая логарифмическая зависимость '[уравнение (37)] при [РЕР]> ~0,25 ммоль/л — прямая с наклоном 2 (пн=2). Следовательно, заполнение одного аллостерического центра PEP повышает каталитическую активность других центров по отношению к PEP. Более того, при постоянной [PEP] увеличение концентрации другого эффектора FDP, который связывается с другими аллостерическими центрами, приводит к активации фермента по отношению к PEP как субстрату. Построение логарифмической зависимости дает Rjt=1,98; эта величина характеризует положительную кооператив-ность по FDP.

При отрицательной кооперативности эффекторы или субстраты понижают связывание последующих молекул субстрата с субстратными центрами или субъединицами аллостерического фермента, и в этом случае всегда «н<1 (рис. 8.10).

Хорошо изучен фермент аспартат-транскарбамоилаза (АТСа-за) из Е. coli; на примере структуры и функции этого фермента можно проиллюстрировать ряд свойств аллостерических фермен-

8. ФЕРМЕНТЫ. I

273

О 2 4 6 8 ??

а Стер · 103

-6.0 -5,0 -4,0 -3,0 -1.0 0 1,0

6 LgfCFDP · Ю3] д Lg[Cpep · 103] .

Рис. 8.11. Кинетический анализ действия дрожжевой пируваткиназы; видна положительная кооперативность при связывании фруктозо-1,6-дифосфата (FDP) (положительный эффектор) и субстрата фосфоеиолпирувата (PEP), а — зависимость V от ГРЕР1 в присутствии и в отсутствии FDP. б и в — графики согласно уравнению (37), позволяющие определить пн для FDP и PEP. \Gutfreund ?., Enzymes: Physical Principles, Wiley — Intersciencs, p. 85, New York, 1972.],

18-1148

274

II. КАТАЛИЗ

тов. АТСаза катализирует первую нз шести стадий биосинтеза ци-тидинтрифосфата (СТР).

9 н о

II I ?, II ? н

?2?—С—О—Р03Н + ?2?—С—СО„Н ?2?—С—N—С—СО,Н----* СТР

I I

сн2 сн,

I \ I 2

C02H COjH

карбамоил- аспарагинооая карбамоиласпарагиновая

фосфат кислота кислота

СТР — отрицательный эффектор АТСазы; следовательно, когда накапливается много СТР, происходит торможение образования карбамонлфосфата. Напротив, если концентрация СТР мала, образование карбамоилфосфата может ускоряться, увеличивая синтез СТР. АТР является положительным эффектором АТСазы, увеличивая (при высоких концентрациях) каталитическую активность •фермента. Действие СТР на АтСазу является одним из многих примеров регуляции, когда конечный продукт метаболического пути, включающего ряд последовательных ферментативных реакций, может временно снижать скорость своего собственного синтеза. На примере рассматриваемой системы видно также, как одно из соединений (в данном случае АТР), участвующее в ряде метаболических процессов вместе с СТР, может влиять на синтез последнего. Такой тип метаболической регуляции на уровне ферментов обсуждается в гл. 11.

АТСаза (молекулярная масса 300 000) при блокировании ионами ртути Hg2+ тиоловых групп диссоциирует на субъединицы двух типов, как это схематически показано на рис. 8.12. Один тип субъединиц С3 является тримером (молекулярная масса 99 000); три-мер обладает каталитической активностью и не чувствителен к действию СТР; в состав молекулы нативного фермента входят две Сз-каталнтические субъединицы. Каждый тример связывает сукци-нат—нереакционноспособный аналог субстрата аспартата (молекула нативного фермента может связывать шесть молекул сукцината) . Другой тип субъединиц R2 является «активным» диме-ром; в молекуле нативного фермента имеются три Р^-регулятор-ные субъеднницы (молекулярная масса 33 000). «Активный» ди-мер связывает СТР, но не субстраты (молекула нативного фермента может связывать шесть молекул СТР). Для реконструкции нативного фермента необходимо освободить тиоловые группы (удалив Hg) и иметь в смеси субъединицы обоих типов. В нативном ферменте имеется шесть ионов Zn2+, и они необходимы при реконструкции фермента из субъединиц. Сильные денатурирующие агенты вызывают диссоциацию активных С3- и Р2-субъединиц на

8. ФЕРМЕНТЫ. 1

275

неактивные мономерные субъединицы С (молекулярная масса 33 000) и R (молекулярная масса 17 000).

При диссоциации фермента в результате обработки солями Hg2+ каталитическая активность увеличивается примерно в четыре раза. График зависимости V от [S] для С3-субъединицы имеет форму гиперболы (рис. 8.13, кривая 1), в то время как для натив-ного фермента такой график имеет сигмоидную форму и смещен вправо (кривая 2). В присутствии СТР график смещается ближе к оси абсцисс (кривая 3). В присутствии положительного эффектора АТР происходит вытеснение СТР; график рассматриваемой зависимости при этом смещается влево. Таким образом, АТР и СТР конкурируют за один и тот же регуляторный центр. Сигмоидный характер кривой для АТСазы в отсутствие СТР показывает, что

Наттшвныи фермент

активная каталитическая субъеои-ница

активная регу-ляторная субъединица

неактивная каталитическая субъеЗ ница

ДСН

неактирная регуляторная. бъеЭ ница

T-состояние

R-состояние ·

Рис. 8.12. а—Схематическая модель субъединичной структуры аспартат-транс-карбамоилазы, показывающая вызываемую добавлением соли ртути диссоциацию иа каталитически активные тримерные субъедииицы (молекулярная масса 99 000> и регуляторные димерные субъединицы (молекулярная масса 34 000); при обработке денатурирующими агентами, например додецилсульфатом натрия (ДСН), образуются неактивные мономерные С- и R- субъединицы, б — модели предполагаемых структур фермента в R (релаксированном) - и ? (компактном)-состояниях (см. рис. 8.9). Субстрат индуцирует R-состояние, а СТР—Т-состояиие.

18*

•276

II. КАТАЛИЗ

15,0 25,0

.5,0 7,5 10,0 12,5 [аспартат] - 103

Рис. 8.13. Зависимость скорости реакции, катализируемой траискарбамоилазой, •от концентрации субстрата. 1 — в присутствии солей ртути: функционирование ¦ фермента подчиняется обычной кинетике Михаэлиса и Яя=1; 2 — нативиый фермент: /1я>1; 3 —в присутствии СТР: кривая сдвинута к абсциссе; Кт имеет более высокое значение, что отражает уменьшение сродства фермента к субстрату, т. е. для достижения той же самой скорости требуется более высокая концентрация аспартата.

пн>1; отрицательный эффектор увеличивает Кт (т. е. требуются 'более высокие концентрации S для насыщения фермента).

Ряд данных позволяет полагать, что АТСаза может находиться в различных конформационных состояниях: в присутствии субстратов в релаксированном или R-состоянии, в то время как в присутствии СТР в компактном или Т-состоянии. 32 тиоловые группы фермента реагируют с ионами Hg2+ в присутствии карбамонл-«фосфата и аспартата быстрее, чем в их отсутствие или в присутствии только одного из субстратов. СТР уменьшает скорость реакции Hg2+ с тиоловыми группами. Следовательно, в R-состоянни ¦фермент имеет менее напряженную конформацию, при этом тио-.ловые труппы оказываются более доступными для взаимодействия 'С реагентом. Кроме того, в присутствии карбамоилфосфата и сукцината коэффициент седиментации фермента оказывается примерно на 4% меньшим, чем в присутствии СТР. Поскольку в этих условиях не происходит диссоциации фермента, различие в значениях коэффициента седиментации позволяет считать, что в R-состоянии молекула фермента является более асимметричной и жмеет более высокий коэффициент трения (разд. 5.2).

Нативная АТСаза в отсутствие сукцината связывает только три тмолекулы карбамоилфосфата, однако в присутствии сукцината

8. ФЕРМЕНТЫ, t

2^7

она связывает шесть молекул карбамоилфосфата; следовательно, АТСаза проявляет гомотроиную положительную кооперативность.

QRe^QRefCPV^QMCPlsS^ C6R*(CP)3S

где CeRe обозначает 12 субъединиц нативного фермента, CP—· карбамоилфосфат, S — сукцинат и CeRe — релаксированное состояние. Для связывания CP как в присутствии, так и в отсутствие сукцината Пн=1; связывание одной молекулы сукцината создает условия для полного насыщения фермента карбамоилфос-фатом; связывание последующих молекул сукцината происходит кооперативно.

8.7.2. Активация ферментов

в результате ковалентной модификации

В ряде случаев ферментативная активность изменяется в результате ковалентной модификации молекулы фермента. При процессах одного типа происходит активация неактивного предшественника фермента

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(07.12.2019)