рвале рН,. наиболее часто при нейтральных рН. В то же время известны исключения; наиболее необычные свойства проявляет пепсин, кото-, рый стабилен в кислой среде и быстро инактивируется в нейтральных и щелочных растворах.

Многие ферменты являются конъюгированными белками, небелковый компонент которых относительно слабо связан с белком. Поскольку для ферментативной активности необходимы оба компонента, то в условиях, вызывающих диссоциацию кофактора, происходит утрата активности. Следует отметить, что подобная диссоциация часто является обратимой; например, пероксидаза диссоциирует на два неактивных компонента в кислой среде, однако при рН 7 активность восстанавливается.

8.5. Ингибирование ферментов

Скорость катализируемой ферментом реакции может быть замедлена специфическими ингибиторами, т. е. соединениями, которые, взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции. Некоторые ингибиторы ферментов являются для живых организмов ядами (например, цианид, сероводород и монооксид углерода). Поскольку токсичность многих ядов обусловлена их ингибирующим действием на ферменты, то ряд проблем токсикологии следует рассматривать с энзимологических позиций. Многие лекарственные препараты также являются ингибиторами, поэтому развитие молекулярной фармакологии также в значительной мере связано с исследованиями процессов ингиби-рования ферментов. Такого рода исследования позволяют получить также весьма важную информацию о самих ферментах.

Различают три типа обратимого ингибирования ферментов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное; их можно различить с помощью кинетического анализа.

8.5.1. Конкурентное ингибирование

Конкурентные ингибиторы способны обратимо связываться с активным центром фермента и конкурировать с субстратом за активный центр. Если активный центр занят ингибитором, он не способен связывать субстрат. Взаимодействие конкурентного ин-

262

П. КАТАЛИЗ

гибитора I с ферментом ? можно записать таким же образом, как и взаимодействие субстрата с ферментом, при этом, конечно, следует помнить, что ингибитор не подвергается химическим изменениям и не превращается в продукт:

? + ? ^—?? (26)

?? — константа диссоциации для фермент-ингибиториого комплекса EI:

Ki — ,???

[El [IJ LEI]"

(27)

Поскольку образование EI зависит от [I] точно так же, как образование ES зависит от [S], наблюдаемая в присутствии конкурентного ингибитора скорость реакции (при постоянной концентрации фермента) зависит от относительных концентраций S и I.

Одним из первых примеров (ставшим в настоящее время классическим) конкурентного ингибирования является действие малоновой кислоты на сукцинатдегидрогеназу, которая в присутствии подходящего акцептора водорода А катализирует реакцию

СООН I

сн, I

сн, I

соон

янтарная кислота

нссоон

нооссн

акцептор фумаровая кислота

АН,

восстановленный акцептор

Многие соединения, структурно сходные с янтарной кислотой, но не способные дегидрироваться, могут соединяться с ферментом, блокировать активный центр и тормозить протекание нормальной реакции. Некоторые ингибиторы сукцинатдегидрогеназы приведены ниже.

соон I

сн2 соон

соон I

соон

соон I

сн, I

сн, I 2 сн, I

соон

Малоновая щавелевая глутаровая кислота кислота кислота

соон

фени лпроп и оновая кислота

Наиболее мощным ингибитором из указанных выше является малоновая кислота. При отношении концентраций ингибитора и субстрата 1 :50 степень ингибирования фермента составляет 50%·

8. ФЕРМЕНТЫ. I

263

Бесконкурентное ингибирование

Тангенс угла

наклона = -J^B-чпах

1/М

Рис. 8.7. Зависимость 1/V от 1/[S], иллюстрирующая различные типы ингибирова-иия ферментативных реакций: а — конкурентное ингибирование [уравнение (28)]; б — неконкурентное ингибирование [уравнение (33)]; в — бесконкурентное ингибирование [уравнение (35)]. Km и Vmax (для неингибированных реакций) и ?? (для ингибированных реакций) определяют по наклонам прямых и отрезкам, отсекаемым на осях.

Увеличение концентрации субстрата при постоянной концентрации ингибитора снижает степень ингибирования, и, напротив, понижение концентрации субстрата увеличивает степень ингибирования. Если бы янтарная и малоновая кислоты связывались с разными участками фермента, было бы трудно объяснить, почему они должны конкурировать друг с другом. Поскольку наблюдается конкуренция, сделано заключение, что они взаимодействуют с ферментом в одном и том же участке активного центра. Структуры всех конкурентных ингибиторов имеют некоторое сходство с соответствующими субстратами.

264

II. КАТАЛИЗ

Конкурентное ингибирование может быть выявлено с помощью кинетического анализа: следует изучить влияние концентрации ингибитора на зависимость V от [S]', используя уравнение Лай-нуивера — Бэрка (11), как это показано на рис. 8.7. Действие конкурентных ингибиторов подчиняется следующему уравнению, в которое входят ?? (константа диссоциации комплекса ??) и [I] (концентрация I):

Все другие обозначения в уравнении (28) идентичны соответствующим в уравнении (II). На рисунке видно, что при конкурентном ннгибировании величина отрезка 1/Vmax остается такой же, как и в отсутствие ингибитора, однако тангенс угла наклона меняется н становится равным 1 + ([I]/Ki). Этого можно было ожидать, так как при насыщающих концентрациях субстрата S, получаемых при экстраполяции на 1/[S]=0, концентрация S столь высока, что связывания ингибитора с активным центром не происходит. Степень ингибирования при меньших концентрациях субстрата зависит от отношения [I]/[S] и значения Кг-

8.5.2. Неконкурентное ингибирование

При рассматриваемом типе ингибирования степень его зависит только от концентрации ингибитора и не зависит от концентрации субстрата, причем в отличие от конкурентного ингибирования образование EI происходит не на том участке фермента, с которым связывается субстрат:

E + I =«=i: EI (29)

и

ES + I =г=ь ESI (30)

где EI и ESI являются неактивными. Следует рассмотреть две константы диссоциации

«" - [Е] [II 131>

и

hs^JESIJ^ ?'" ~ [ESI] ???>

Уравнение для неконкурентного ингибирования (в двойных обратных величинах) запишется следующим образом:

¦^-&('+-8г)ж+т=-('+*)

8. ФЕРМЕНТЫ. I

265

где обозначения те же, что и в уравнении (28), а Кг— константа ингибирования, учитывающая суммарное влияние Kf1 и ??? (которые могут иметь как одинаковое, так и разное значение). Результаты графического анализа уравнения (33), приведенные на рис. 8.7, показывают, что как наклон, так и величина отрезка, отсекаемого на оси ординат, отличаются от соответствующих параметров для неингибированной реакции на величину 1 + [I]//Cf. Неконкурентные ингибиторы взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента; при этом они вызывают существенные изменения конформации фермента, в результате чего нарушается нормальное взаимодействие активного центра с субстратом. Примерами неконкурентных ингибиторов являются ноны тяжелых металлов, например Ag+, Hg2+ и Pb2+, реагирующие с тиоловыми группами фермента, и хелат-образующие реагенты, взаимодействующие с ионами металлов, необходимыми для активности.

Многие соединения необратимо взаимодействуют с ферментом, образуя ковалентные производные либо в области активного центра, либо в другой части молекулы (непосредственно не участвующей в фермент-субстратном взаимодействии). Эти соединения в строгом смысле не являются неконкурентными ингибиторами, поскольку они необратимо инактивируют фермент. Например, единственная тиоловая группа активного центра папаина быстро реагирует с иодацетатом, в результате образуется остаток S-карбок-симетилцистеина (разд. 6.1.1). Степень инактивации папаина этим ингибитором прямо пропорциональна степени S-карбоксиме-тилирования. Иодацетат инактивирует также некоторые ферменты, у которых тиоловые группы локализованы вне области активного центра; в этих случаях потеря активности связана с изменением конформации фермента. В гл. 9 рассмотрен ряд других соединений, образующих ковалентные производные специфических групп ферментов и нашедших широкое применение как реагенты для идентификации групп, ответственных за ферментативную активность.

8.5.3. Бесконкурентное ингибирование

Ингибирование бесконкурентного типа наблюдается в том случае, когда ингибитор обратимо взаимодействует только с ES, что приводит к комплексу ESI, не способному образовывать продукты. В этом случае

[ES] [I] [ESI]

(34)

? 266

II. КАТАЛИЗ

и кинетика ингибирования описывается следующим уравнением:

[обозначения те же, что и в уравнениях (28) или (33)]. При графическом анализе (рис. 8.7) видно, что изменяется только величина отрезка, отсекаемого на оси ординат, а наклон прямой остается таким же, как и для неннгибированной реакции. При увеличении концентрации субстрата действие бесконкурентного ингибитора (аналогично действию неконкурентного ингибитора) не снижается. Ингибирование рассматриваемого типа обычно встречается в случае ферментативных реакций с участием двух (или большего числа) субстратов.

8.6. Ингибиторы метаболизма: антиметаболиты

Значение результатов исследований по «торможению» активности ферментов соединениями, сходными по структуре с естественными субстратами, выходит за рамки исследования изолированных ферментных систем. Так, фармакологам уже давно известно, что соединения, имеющие структуру, сходную со структурой определенных физиологически активных веществ, могут конкурировать с последними. Хотя во многих случаях сведения о ферментах, участвующих в реализации рассматриваемого физиологического явления, отсутствуют, имеются указания, что многие фармакологически активные соединения изменяют течение метаболических процессов в результате их действия на ферменты или ферментные системы.

Известно, что высшие животные и многие микроорганизмы не способны синтезировать некоторые органические соединения, являющиеся для них жизненно необходимыми, и должны получать их в готовом виде. Потребности разных видов различны;