ер, переаминирование, катализируемое глутамат-аспартат-аминотрансферазой (гл. 20).

Последовательные механизмы представлены двумя видами — упорядоченным и неупорядоченным. В противоположность пинг-понг-механизму при последовательном механизме оба субстрата должны соединиться с ферментом и образовать тройной комплекс,, прежде чем произойдет образование продукта. Реакцию по упорядоченному механизму можно записать в виде следующей схемы::

а в cd

1 1_? ?

? + a ea + в ^=± (eab =^=? ecd) ed ?

II. КАТАЛИЗ

Субстрат А связывается с ферментом Е, образуя комплекс ЕА, который в свою очередь связывает субстрат В. Тройной комплекс ЕАВ превращается в тройной комплекс ECD, из которого последовательно (как показано) освобождаются продукты. По упорядоченному механизму функционируют, например, фосфофрукто-киназа (гл. 14) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (гл. 14).

В других случаях на ферменте ? имеются независимые участки связывания для А и В, и скорость реакции не зависит от того, какой субстрат А или В связывается с ферментом первым. В таких случаях говорят, что механизм является неупорядоченным. Если также при распаде тройного комплекса ECD ни один из продуктов не имеет перед другим «преимуществ» освобождаться первым, то схема неупорядоченного механизма может быть изображена следующим образом:

А В CD

Примерами ферментов, функционирующих по неупорядоченному механизму, являются ТЛОРгалактоза : ?-ацетилглюкозамин-галак-тозилтрансфераза (разд. 8.7.2.3) и креатинкиназа (гл. 10).

Известны более сложные кинетические механизмы для реакций с тремя и даже четырьмя субстратами. Такие реакции могут ¦осуществляться либо по последовательному механизму, либо по линг-понг-механизму, либо по смешанному механизму.

8.4.5. Влияние температуры

Константа равновесия любой химической реакции, как и скорость реакции, сильно зависит от температуры, и ферментативные реакции не являются исключением. Влияние температуры на константу равновесия химической реакции выражается уравнением Вант-Гоффа

ДЯ

2,3\gK = C--^r (19)

тде АН — тепловой эффект реакции (в калориях на моль), R — газовая постоянная, равная 1,98 кал-моль-1-град-1, ? — абсолютная температура, С—-константа интегрирования. Из уравнения следует, что график зависимости IgK от обратной температуры 1/7 должен быть прямолинейным. Наклон прямой равен ДЯ/2,3 R. Влия-

8. ФЕРМЕНТЫ. I

257

Рис. 8.6. Влияние температуры на константу скорости k2 гидролиза кар-бобензоксиглицил фенилаланина (CGP) и карбобензоксиглицилтрипто-фана (CGT) кристаллической карбок-сипептидазой. Приведены зависимости lgk2 от обратной абсолютной температуры. Кажущиеся энергии активации Еа составляют 9900 кал/моль для CGT и 9600 кал/моль для CGP. [Lymry R., Smith ?. L., Glantz R. R., J. Am. Chem. Soc, 73, 4330, 1951.]

(1/T) · 10+

ние температуры на скорость реакции выражается уравнением Ар-рениуса

2,3 1g? = fi--Jfr (20)

Это уравнение имеет такой же вид, как уравнение (19), оно выражает константу скорости реакции k через Т, R и Еа, энергию активации (разд. 8.1.7) в калориях на моль, и константу В, которая (качественно) характеризует частоту столкновений молекул и необходимость определенной взаимной ориентации сталкивающихся молекул. Для двух значений температуры по уравнению (20) можно записать

k' Ea ? 1 1 \

2·31^ =-rf (?^-?7-) ("J

где k' и k" — константы скорости при температурах V и Т" соответственно.

На рис. 8.6 показано влияние температуры на константу скорости k2 при гидролизе карбоксипептидазой двух субстратов. Это типичный график Аррениуса для катализируемой ферментом реакции; он показывает, что в данном случае зависимость \gk2 от 1/Т линейна в области между 5 и 25°С; по наклону прямой можно рассчитать Еа. При повышении температуры скорость ферментативных реакций увеличивается только до определенного максимального значения; при дальнейшем повышении температуры происходит снижение скорости реакции вследствие тепловой денатурации фермента.

17—1148

258

И. КАТАЛИЗ

8.4.6. Энергия активации

Энергия активации — это энергия, необходимая для перевода! молекул в реакционноспособное состояние (разд. 8.1.6). Катализатор понижает энергию активации реакции, которая может протекать и спонтанно в отсутствие катализатора. В табл. 8.2 приведены энергии активации некоторых процессов. Энергия активации разложения пероксида водорода составляет 18 ООО кал/моль; она

Таблица 8.2

Энергии активации некоторых реакций при ферментативном и неферментативном катализе

Реакция Катализатор Ва, кап/моль

Разложение перокснда водорода Без катализатора Коллоидная платина Каталаза 18 ООО-11 700 <2 000-

Гидролиз этилбутнрата Водородные ионы Гидроксидыые ионы Панкреатическая липаза 16 800 10 200 4Е00

Гидролиз казенна Водородные ионы Трипсин 20 600 12 000

Гидролиз сахарозы Водородные ионы Дрожжевая инвертаза 25 600 8000—10 000

Гидролиз ?-метилглюкозида Водородные ноны ?-Глкжозидаза 32 600 12 200

понижается до 11 700 кал/моль в присутствии в качестве катализатора коллоидной платины и значительно уменьшается в случае ферментативной реакции. Очевидно, что для рассматриваемой реакции каталаза является значительно более эффективным катализатором по сравнению с неорганическим катализатором. Каталаза столь эффективна, что ферментативная реакция характеризуется лишь весьма незначительной энергией активации. Известно, что разложение пероксида водорода каталазой протекает со скоростью, которая является одной из наивысших для ферментативных реакций.

Рассмотрение других данных табл. 8.2 показывает, что подобные же соотношения характерны и для других систем: неорганический катализатор понижает энергию активации,, но фермент снижает ее в еще большей степени. О большой эффективности ферментов как катализаторов свидетельствуют высокие скорости ферментативных реакций при физиологических температурах. Другими словами, благодаря низкому значению Еа реакция может

«. ФЕРМЕНТЫ. I

259

протекать с высокой скоростью при относительно низкой температуре. Это можно легко показать, сопоставляя значения констант скоростей данной реакции, протекающей при определенной температуре (37 СС), при различных энергиях активации. В качестве примера можно рассмотреть приведенные в табл. 8.2 данные для, гидролиза сахарозы, катализируемого дрожжевой ннвертазой и водородными ионами.

Согласно уравнению (20), для ферментативной реакции (индекс е) имеем

Ве 8000 Ig*e— 23 — 2,3RT (22)

и для реакции, катализируемой водородными ионами (индекс п):

1аЬ Вь 25 600

Предположим, что Ве и В]г примерно равны. Для того чтобы найти отношение констант скоростей рассматриваемых реакций (катализируемой ферментом и катализируемой водородными нонами), вычтем уравнение (23) нз уравнения (22) и подставим значения #=1,98 и 7"=37 + 273=310. Получаем

ке 25 600—8 000 17 600 ,g kh = 2,3-1,98-310 = 1415 ~ 12,4 <24)

И

= 2,5-1012 (25)

Другими словами, можно ожидать, что при одной и той же температуре константа скорости ферментативной реакции в ~1012раз выше константы скорости реакции, катализируемой водородными ионами.

8.4.7. Влияние рН

рН оказывает выраженное влияние на скорость ферментативных реакций. Для каждого фермента имеется определенное значение рН, при котором скорость реакции оптимальна (оптимум рН), при отклонении в любую сторону от этого значения рН скорость реакции снижается. В табл. 8.3 приведены значения опти-мумов рН для ряда хорошо изученных ферментов. Очевидно, что значения оптимума рН находятся в очень широкой области, например кислая среда для пепсина и щелочная среда для щелочной фосфатазы. На практике при проведении исследований с использованием ферментов необходимо поддерживать постоянное значение рН с помощью соответствующих буферных растворов;

17*

260

П. КАТАЛИЗ

Таблица 8.3

Оптимумы ? ? действия некоторых гидролитических ферментов Фермент Субстрат Оптимум рН

Пепсин Яичный альбумин Казеин Гемоглобин Карбобензоксиглутамилтирозин 1.5 1,8 2,2 4,0

а-Глюкозидаза а-Метилглюкозид Мальтоза 5.4 7,0

Уреаза Мочевина 6,4—6,9

Трипсин Белки 7,8

Панкреатическая а-амилаза Крахмал 6,7—7,2

?-Амилаза солода Крахмал 4,5

Карбоксипептидаза Различные субстраты' 7,5

Щелочная фосфатаза плазмы 2Тлнцерофосфат 9—10

Кислая фосфатаза плазмы 2-Глнцерофосфат 4,5—5,0

Аргиназа Аргинин 9,5—9,9

следует, однако, иметь в виду, что природа буфера может влиять на положение оптимума рН.

Влияние рН на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено различными факторами. Ферменты, подобно другим белкам, являются амфолитами и имеют большое число ионоген-ных групп. Если функционирование фермента зависит от наличия некоторых специфических группировок, то каждая из них в данных условиях должна находиться в определенном состоянии (не-ионизированном или ионизированном). Нередко оказывается возможным идентифицировать участвующие в катализе ноногенные, группы активного центра путем анализа зависимости активности фермента от рН и сопоставления полученных данных с известными величинами р/С' ионогенных групп белков (табл. 5.2). В качестве примеров можно указать на идентификацию каталитически активных остатков гистидина в активных центрах трипсина, химотрипснна и субтилнзина и тиоловой группы в активном центре папаина (гл. 9). На участие ионогенных групп в функционировании ферментов указывает также влияние ионной силы на скорость ряда ферментативных реакций (это влияние сильно выражено при действии карбоксииептидазы и уреазы). Такого рода эффект обычно наблюдается при неферментативном катализе, осуществляемом ионогенными соединениями.

8. ФЕРМЕНТЫ. I

261.

Во многих случаях субстраты являются электролитами, и реакция может осуществляться лишь с определенными (ионизированными или неионизированными) их формами.

Концентрация водородных ионов может влиять на действие ферментов и косвенным путем, поскольку многие ферменты, как и. вообще белки, стабильны только в ограниченном инте