симость V от [Et] линейна.

250

II. КАТАЛИЗ

лекса ES, а также некоторых дополнительных допущений, которые были введены позднее.

Принято, что концентрация субстрата S намного больше, чем концентрация фермента Е; в рассмотрение включены только начальные скорости, т. е. скорости, определенные в условиях, когда только очень небольшая доля S превращается в Р. В этом случае из ? практически не образуется ES и стадией Е + Р—>-ES можно пренебречь. Общая концентрация фермента в системе [Е(] равна

[EJ = [Е] + [ES] (2)

где [Е] — концентрация свободного фермента, [ES] — концентрация комплекса ES. Скорость реакции V равна

V = *2[ES] (3)

Это, по существу, уравнение скорости для реакции (1), однако им нельзя воспользоваться для расчетов, поскольку ни k2, ни [ES] не могут быть непосредственно измерены. Максимальная скорость Vmax равна

Ее можно определить, поскольку Vmax не может превышать той скорости, которая наблюдается при полном насыщении фермента субстратом. Наконец, принимается допущение, что реакция протекает в стационарных условиях, т. е. скорость изменения [ES] равна нулю (d[ES]/dt=0) и, следовательно, [ES]| не изменяется в течение времени, необходимого для измерения скорости.

Скорость Vf образования комплекса ES пропорциональна [Е] и [S], как в любой реакции второго порядка:

»/ = *? [Е] [S] = ky ([Et] - [ES]) [S] (5)

Скорость va распада комплекса ES равна

щ = [ES] + k2 [ES] = + k2) [ES] (6)

Поскольку в стационарном состоянии d[ES]/dt=0, то V] = va, следовательно,

kj. ([Et] - [ES]) [S] = + k2) [S] (7) Преобразуя уравнение (7), получаем

[SI ([Ed - [ES]) + h jr

[ES] - ~*m (b>

где Km (включающая все три константы скорости) называется константой Михаэлиса; это весьма важный параметр, характеризующий каждую пару фермент — субстрат.

Преобразуя уравнение (8), получаем выражение для [ES]:

IESI= Km + iS] <9>

8. ФЕРМЕНТЫ. I

251

Подставляя в уравнение (9) V/k2 вместо [ES] [из уравнения (3)] и вместо [Et] [из уравнения (4)J, получаем окончатель-

ное выражение уравнения Михаэлиса — Ментен

"-та- <"»

Рассмотрим теперь методы определения Vmai и К т по результатам измерения V при различных концентрациях [S]. По гиперболической кривой, приведенной на рис. 8.3, можно определить Km, однако определить с необходимой точностью Vmai нельзя, поскольку в эксперименте часто не удается достичь концентрации субстрата, достаточной для насыщения фермента. Используя, однако,

V/DSJ

в

Рис. 8.4. Зависимости, используемые для определения Km и Ушах ферментативных реакций. Для нескольких концентраций субстрата вычисляют скорости и строят соответствующие зависимости. По наклонам прямых и отрезкам, отсекаемым на осях, находят Km и Vmax. Зависимости построены согласно: а — уравнению (11); б — уравнению (12); в —уравнению (13).

252

II. КАТАЛИЗ

выражение, обратное уравнению (10), получаем следующее линейное уравнение, называемое уравнением Лайнуивера — Бэрка:

1 Кт 1 . I

(?)

График зависимости 1/V от 1/[S], приведенный на рис. 8.4, представляет собой прямую с наклоном Km/Vmax, отсекающую на оси ординат отрезок 1/Vmax- Поскольку на графике легко измерить угол наклона и отрезок на оси ординат, то можно достаточно точно определить Vmax

и Km- Можно также умножить обе части уравнения (11) на [S], тогда

[S] Кт [S]

(12)

После умножения обеих частей уравнения (11) на Vmax и соответствующих преобразований получим

У=-Кт~Щ- +Vmax (13)

Графики уравнений (12) и (13) также представляют собой прямые; их можно использовать для определения Кт и Vmax» как показано на рис. 8.4.

8.4.2. Природа Кт

Особый интерес представляет следующее уравнение, полученное путем решения уравнения (10) относительно Кт:

*m=[S](-^f--l) (И)

При такой концентрации [S]1, когда V=l/2 Vmax, уравнение (11) преобразуется в следующее:

Кт= [S]

Следовательно, Кт совпадает с концентрацией субстрата (в молях на литр), если скорость реакции равна половине максимальной Vmax.

Km является сложной константой, поскольку Km= (k-\-\-k2)lk[. Следует рассмотреть три возможности. Во-первых, если k-X значительно больше k2, то можно пренебречь k2, и Km=k~\lk\. Тогда Кт~ термодинамическая константа равновесия для обратимого образования комплекса ES. Во-вторых, если k2 значительно больше k-i, то Km = k2jk\, и Кт — стационарная константа, содержащая две независимые константы скорости. И наконец, в-третьих, если k-i и k2 — величины одного порядка, то Кт определяется

8. ФЕРМЕНТЫ. I

253

всеми тремя константами скорости. При исследовании различных ферментных систем наблюдаются все три рассмотренных выше случая.

Уравнение скорости Михаэлиса — Ментен (10) выведено при допущении, что скорость стадии Р + Е-*-ЕР практически равна нулю, поскольку определяется начальная скорость прямой реакции. Это уравнение, однако, применимо также и в случае ферментативных реакций, константа равновесия которых близка к единице, т. е. для обратимого взаимопревращения S и Р. Так, уравнение Холдена связывает Кр с константами скоростей для прямой и обратной реакций, а также с Km и Ушах-

rr [pip *л vLA

К*- |S]P - - (,5)

где верхние индексы S и ? относят соответствующие параметры к субстрату и продукту соответственно. К^ и 1^аХ для обратной реакции определяют таким же путем, как было описано выше для прямой реакции. Для обратимой системы правильность определения кинетических констант по уравнению (11) может быть проверена по уравнению (15), поскольку Кр легко рассчитать по равновесным концентрациям. Для фермента фумаразы, которая катализирует обратимое взаимопревращение фумарат + Н2Оч±ма-лат, константа равновесия, рассчитанная по известным концентрациям малата и фумарата, составляет /Ср=4,4. Значение ?? можно найти, используя следующие определенные экспериментально параметры: /С?ал=2,5-10-5 моль/л, /С*ум =0,5-10"5 моль/л, V^ = = 54 ООО мин-1 и Vb? =48 ООО мин"1.

Уравнение (1) отражает механизм ферментативной реакции в крайне упрощенном виде, поскольку несомненно, что в ходе катализа фермент образует не один, а большее число промежуточных комплексов. Например, вначале фермент связывает субстрат, образуя комплекс ES, затем переходное состояние ESP, далее ЕР и, наконец, Е + Р:

E+S ч—* ES < > ESP 4=fc ЕР 4=fc Е + Р (16>

Включение дополнительных комплексов, как например, в уравнении (16), не изменяет общей формы уравнения Михаэлиса — Ментен (10), вывод которого был сделан на примере упрощенного уравнения (1).

8.4.3. Порядок реакции при ферментативном катализе

Порядок ферментативной реакции может изменяться во времени; для обсуждения этого вопроса следует воспользоваться кри-

254

II. КАТАЛИЗ

вой Михаэлиса — Ментен (рис. 8.5). Рассмотрим соотношения, получаемые из уравнения (9) для высоких и низких концентраций субстрата, поскольку именно такие условия характерны для начала и завершения катализируемых ферментами реакций. Если [S] много больше Кт, т. е. концентрация субстрата очень высока (плато на кривой рис. 8.5), то

—^-=V=Vaia=kalEt] (17)

Скорость реакции постоянна (при данной концентрации фермента). В этих условиях фермент насыщен субстратом и реакция протекает с максимальной скоростью, т. е. дальнейшее увеличе-яие [S] не изменяет скорости.

При снижении концентрации субстрата до значений, значительно меньших по сравнению с Кт (нижняя часть кривой на рис. 8.5), видно, что

- dlS1 ^у= V™*lS] ^ клШВ (18)

dt Кт Km

т. е. скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата.

?.4.4. Кинетика двухсубстратных ферментативных реакций

Большинство ферментов катализирует реакции, в которых участвует не один, а большее число субстратов, например А-г-В^*С~)-+D. В ходе этих реакций также происходит образование фермент-субстратных комплексов, подобно тому как это имеет место в. односубстратных реакциях, и при исследовании кинетики двухсубстратных реакций могут быть определены Кт для каждого из субстратов и Vmax для реакций. Константы Кт для каждого из субстратов определяют графически [уравнения (II—13)] из за-

Рис. 8.5. Теоретический график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Когда V= = Vmax. скорость не зависит от концентрации субстрата (реакция нулевого порядка). Когда концентрация субстрата мала по сравнению с Кт, скорость пропорциональна концентрации субстрата (реакция первого порядка) .

8. ФЕРМЕНТЫ. I

255

висимости начальной скорости от концентрации одного из субстратов при фиксированной (обычно насыщающей) концентрации другого субстрата.

Выведены уравнения скорости для двухсубстратных реакций, аналогичные уравнению Михаэлиса — Ментен; использование этих уравнений способствовало выяснению общего механизма изучаемых реакций и позволило определить значения соответствующих кинетических параметров Кт и Vmax. Эти уравнения весьма сложны, и интересующиеся могут обратиться к более специализированным руководствам. Полезно, однако, рассмотреть два основных механизма двухсубстратных реакций: механизм двойного замещения и последовательный механизм.

Если реакция A+B^C+D осуществляется по механизму двойного замещения, то вначале субстрат А присоединяется к ферменту, образуя комплекс ЕА, затем освобождается первый продукт С; при этом образуется стабильный интермедиат F, отличающийся от Е. Далее интермедиат F взаимодействует со вторым субстратом В, образуя фермент-субстратный комплекс FB, из которого" образуется второй продукт D и освобождается фермент Е. Реакции этого типа могут быть записаны различным образом, приводимая ниже форма записи хорошо иллюстрирует механизм двойного замещения:

а с в d

_j_? 1 ?

? + a (ea fc) f + ? (fb ?=± fd)-?-»e

где А, В, С и D — субстраты и продукты, ? — фермент, F — стабильный интермедиат; обозначения, взятые в скобки, — предполагаемые интермедиаты. По горизонтали последовательно расположены формы фермента, образующиеся в ходе реакции, а стрелки указывают на присоединение субстратов и диссоциацию продуктов. Этот механизм называют также «пинг-понг»-механизмом. По такому механизму осуществляется, наприм