калибровки препаратов ДНК с известным составом позволяет вычислить содержание G + C и A-f-T неизвестной ДНК. Такое определение следует проводить при фиксированной ионной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК. 3 начение 1пл можно снизить, добавляя мочевину — реагент, разрушающий водородные связи и препятствующий гидрофобным взаимодействиям. Например, в 8 ? мочевине Гпл снижается до ~20°С. В 95%-ном формамиде ДНК полностью разделяется на две нити при комнатной температуре.

7.2.8.5. Влияние рН

Двуспиральная структура ДНК разрушается также при кислых и щелочных значениях рН, при которых на пуриновых и пиримидиновых основаниях могут появляться заряженные группировки. Вблизи рН 12 ионизация енольных гидроксидных групп предотвра-

* Число водородных связей не определяет прочности пары. Так, 2-аминоаде-иин дает комплекс с тимином с тремя водородными связями, который по прочности сравним скорее с парой А—Т, чем G—С. — Прим. перев.

15—J 148

226

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Рис. 7.5. Зависимость Т„„ от содержания G+C. Точки соответствуют образцам ДНК из различных источников. [Doty Р., р. 8, in: D. J. Bell, J. К. Grant (eds.), The Structure and Biosynthesis of Macromolecules, Biochemical Society Symposia, № 21, Cambridge University Press, New York, 1962.]

щает связывание кето- и аминогрупп за счет водородных связей. Аналогично в кислых растворах вблизи рН 2—3, при которых ???-тонируются аминогруппы, спираль разрушается.

7.2.9. Ренатурация ДНК

Денатурация ДНК — процесс обратимый. Если ДНК только частично денатурирована, например при нагревании, то при снижении температуры происходит быстрая ренатурация каждой молекулы ДНК, скорость которой соответствует реакции первого порядка. Если ДНК полностью денатурирована, две комплементарные нити будут реассоциировать медленно («отжиг» ДНК). Этот процесс включает две стадии: сначала по реакции второго порядка происходит сборка комплементарных последовательностей двух нитей, а затем по реакции первого порядка — быстрое их «защелкивание». Если начальная концентрация денатурированной ДНК Со (молярная концентрация фосфата ДНК), то изменение концентрации С одноцепочечной ДНК во времени подчиняется уравнению реакции второго порядка dc/dt=K2C2, интегральная форма кото-

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

227

Число нцклеогпидных пар 1 10 101 103 10* 10' 10« 10' 10" 10» 10я

?-? ?-1 ?-1-1-1-1-1-1

C0i# моль-с-л-1

Рис. 76. Ренатурация двухцепочечиых нуклеиновых кислот из различных источников. [Britten R. /., Kohne D. ?., Science, 161, 529, 1968.]

рого С/С0= 1/(1+/?2^70?). Скорость ренатурации обычно оценивается по графику зависимости С/С0 от lg C0t (рис. 7.6). Построив график, можно найти Coii/2, где ??/2 —время, при котором С/С0 = = 0,5, а также константу скорости реакции второго порядка Кг,

равную-тгт—. Константа Кг — характеристический параметр для Со»/2

данной ДНК; она обратно пропорциональна N — числу пар оснований ДНК (если ДНК не имеет повторяющихся последовательностей). СоЛ/2 прямо пропорционально ? (? называется сложностью ДНК). Этот метод позволяет определить для бактериальных и вирусных ДНК значения ?, согласующиеся со значениями, полученными другими методами.

7.2.10. Размер ДНК

Молекулы ДНК длинные и неразветвленные. Их размер можно охарактеризовать тремя параметрами — длиной, числом нуклеотид-ных пар и массой. Так, ДНК длиной 1 мкм (Ю-4 см) содержит 3000 пар оснований и имеет массу 2-106 дальтон (660 дальтон на 1 пару оснований для Ыа+-соли). Первоначально предполагалось, что ДНК должна быть не длиннее, чем 15 000 пар оснований (5· Ю-4 см), пока не было найдено, что она легко рвется под действием гидродинамических сил. При осторожной работе, исключающей гидродинамический разрыв, можно выделить значительно более длинные молекулы ДНК (табл. 7.4).

15*

228 I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Таблица 7.4 Размер различных молекул ДНК

Организм Среднее число пар оснований на хромосому, Х10-3 Д^ина, см Число хромосом (гаплоидный набор) Форма

Вирус 40 (SV40) 5,1 0,С0017 1 Кольцевая

обезьяны

Бактериофаг 0X174 5,4 0.00Э18 1 Кольцевая одно-

цепочечная; двой-

ная репликативная

Бактериофаг ? 46 0,0015 I Линейная

?. coli 4 000 0,13 1 Кольцевая

Дрожжи 1 ООО 0,33 17

Drosophila melanoga- 41 СОО 1,4 4

ster

Человек 125 ООО 4,1 23

Длину молекул ДНК, содержащих от 3· 102 до 3-105 нуклеотид-ных пар, можно измерить непосредственно с помощью электронного микроскопа. Молекулы ДНК с размерами нуклеотидных пар от 2-102 до 2-10* можно разделить на пористых гелях агарозы, используя молекулярно-ситовый эффект.

Классическим методом определения размеров ДНК является седиментация в центробежном поле. Скорость седиментации молекул пропорциональна силе поля со2г и определяется уравнением drfdt=S(u2r, где со — угловая скорость и г — расстояние до центра вращения. Коэффициент седиментации s связан с молекулярной массой ДНК эмпирическим уравнением s = 0,0882- 1СИ3 ??°·34?. Определение размера ДНК с помощью центрифугирования ограничено областью от 3-102 до 1,5· 106 пар оснований из-за гидродинамических разрывов более длинных молекул.

Для определения с помощью седиментации размера молекул ДНК, содержащих более 108 нуклеотидных пар, используют новую технику вязкоэластичного замедления. В этом случае в раствор ДНК, размер молекул которой измеряют, погружают ротор и очень медленно поворачивают его с помощью внешнего магнитного поля. Когда магнитное поле выключается, ротор возвращается в первоначальное положение за счет энергии, накопленной в эластично растянутых молекулах ДНК. Скорость, с которой ротор возвращается в первоначальное положение, является функцией молекулярной массы самых больших молекул ДНК в растворе и связана с ней уравнением ??=2,2· 108?0·6, где ?—время вязкоэластичного замедления (в секундах), ? находят по уравнению ?(?)—?(??) =

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

229

=6(0)е~'/т, где ? — угол поворота ротора, измеренный в момент времени t, оо и 0.

Найдено, что длина ДНК в самой большой хромосоме Drosophi-la melanogaster, измеренная этим методом, находится в хорошем соответствии с массой ДНК, определенной цитологическими методами. Из этих измерений следует важный вывод, что хромосомы животных, подобно бактериальным и вирусным хромосомам, содержат по одной непрерывной ДНК-спирали. Длина молекулы ДНК в самой большой хромосоме человека может достигать 8 см и более.

7.2.11. Топология ДНК

Изолированные молекулы ДНК могут быть линейными, т. е. содержать два конца, или циклическими (табл. 7.4). Однако ДНК обычно существует не в вытянутой форме, а плотно упакована в хромосоме клетки или в головке вируса. Хотя длина ДНК самой большой хромосомы человека может составлять 8 см, она так упакована в хромосоме, находящейся в состоянии митоза, что ее длина составляет всего 5 нм.

Если обе нити циклической двуспиральной ДНК, например ДНК вируса SV40 или репликативной формы ДНК фага 0X174, замкнуты, т. е. сахарофосфатная цепь непрерывна, то они могут иметь суперспиральную или суперскрученную конформацию.

Суперспирализация имеет место, когда в правовращающей спирали ДНК число пар оснований на единицу длины больше стандартного и, как следствие, образуются отрицательные супервитки (рис. 7.7). Суперспирализация может быть нарушена расщеплением одной или двух нитей, например действием дезоксирибонукле-

Рис. 7.7. Схематическое изображение эффектов связывания этидийбромида с ДНК вируса SV40. а — молекула ДНК (без красителя) с 14 отрицательными супервитками; б — при связывании 420 молекул красителя супервитки полностью исчезают; в — при дальнейшем связывании 720 молекул красителя молекулы ДНК переходят в состояние с 24 положительными супервитками. \Bauer W., Vinograd J.,

J. Mol. Biol., 33, 141, 1968.]

230

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

азы. Вторым методом является интеркаляция плоских молекул, таких, как этидийбромид, между стопками пар оснований.

Этидийбромид

Интеркаляция одной молекулы этидийбромида раскручивает суперспираль на 12°, так что требуется 30 молекул этидийбромида на один суперспиральный виток. Когда отрицательные суперспиральные витки полностью раскручены, дальнейшее добавление этидийбромида вызывает появление новых витков суперспирали, но теперь в положительном направлении (рис. 7.7).

7.2.12. Белки, связанные с ДНК

У прокариот (бактерий и сине-зеленых водорослей) ДНК связана с незначительным количеством белка. На каждый межнуклео-тидный фосфат ДНК, так же как и РНК, приходится одна анионная группа с p/Ce«il. Следовательно, нуклеиновые кислоты при нейтральных рН существуют в виде солей Na+, Mg2+ или других катионов. В некоторых бактериофагах и растительных вирусах нуклеиновые кислоты связаны с ди- и полиаминами, такими, как кадаверин, путресцин, спермин и спермидин (гл. 22).

У эукариот ДНК находится в таких цитоплазматических орга-неллах, как митохондрии (гл. 12), хлоропласты (гл. 16), а также в хромосомах ядер. Ядерная ДНК клеток растений и животных соединена с основными белками — гистонами, которые связаны с ДНК не ковалентно, а с помощью ионных и, возможно, иных дополнительных взаимодействий. В хромосомах присутствует также небольшие количества кислых белков.

Комплекс ДНК с гистонами, называемый хроматином, может быть выделен из интерфазного ядра. Этот комплекс содержит ДНК и гистоны в приблизительно равных количествах.

7.2.12.1. Гистоны

Эти белки обычно получают экстракцией ядер или хроматина разбавленными кислотами (0,2 ? НС1). Они осаждаются из раствора щелочами при рН~10 или путем высаливания. Разделение

7. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

231

гистонов на индивидуальные достигается гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией или электрофорезом. Существует пять основных классов гистонов, некоторые из которых подразделяются на подклассы. Одни и те же классы гистонов были найдены во всех изученных клетках животных и растений. В