Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

-ниц также проявляют ферментативную активность и в комбинации с димерами R-субъединиц образуют молекулу с субъединичной структурой (Рч2)з(Сз)2 (разд. 8.7.1). Исходя из этих данных, а так-

¦200

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

же данных электронной микроскопии, была предложена модель четвертичной структуры фермента (рис. 6.16).

Электронная микроскопия широко используется для изучения вирусов, причем данные о размерах последних позволяют выяснить существенные детали их структуры. На рис. 6.17 представлена электронная микрофотография вируса желтой мозаики репы, а также построенная на этой основе модель вируса, состоящая из расположенных на его поверхности 32 структурных единиц, 12 из которых представляют собой циклические системы нз 5 субъединиц, а 20 — циклические системы из 6 субъединиц. В целом в состав вируса входит 180 белковых субъединиц с молекулярной массой 21 ООО каждая (табл. 6.2).

6.7. Белки-предшественники и ансамбли белков

Многие полипептиды и белки синтезируются в виде цепей, имеющих большее число аминокислотных остатков, чем конечные функционально-активные структуры, присутствующие в клетке или секретируемые в кровь и другие жидкости организма. Так называемый «процессинг» этого предшественника с образованием более короткого белка осуществляется с участием ряда протеолитичес-ких ферментов. Здесь будет приведено лишь несколько примеров таких превращений, более подробная информация представлена в последующих главах. Один из примеров зимогенов (неактивных предшественников протеолитических ферментов) —трипсиноген, который при гидролизе одной пептидной связи превращается в активный фермент — трипсин (гл. 8). Фибриноген представляет собой растворимый белок плазмы крови, превращающийся в результате протеолиза в нерастворимый фибрин кровяных сгустков, предохраняющих организм от больших потерь крови при поражении кровеносных сосудов (гл. 29). Проинсулин, состоящий из одной полипептидной цепи с внутримолекулярными дисульфидными мостиками, в результате протеолиза дает активный инсулин, состоящий из двух пептидных цепей и образующийся за счет выщеплення внутреннего пептидного сегмента из полипептидной цепи предшественника (гл. 46). Наконец, состоящий из трех цепей нерастворимый фибриллярный белок, коллаген, образуется в результате протеолитического расщепления предшественников, имеющих более длинные аминокислотные последовательности (с дополнительными пептидными сегментами в ???- и СООН-концевых частях), чем цепи коллагена (гл. 38). Эти примеры иллюстрируют также возможные пути участия протеаз в контроле биологических процессов.

6. БЕЛКИ. Ill

6.8. Спектральные методы обнаружения конформационных переходов в белках ¦>_.

6.8.1. Спектры поглощения

Белки, как правило, поглощают УФ-излучение в трех областях: >250 нм (с пиком вблизи 280 нм), где поглощение определяется исключительно присутствием остатков ароматических аминокислот (разд. 4.2.1), при 210—250 нм, где поглощение определяется присутствием ароматических и других аминокислотных остатков, а также наличием водородных связей и других взаимодействий, зависящих от конформации белка и содержания в молекуле ?-спиралей, и <210 нм главным образом благодаря поглощению пептидными связями, а также в связи с различными конформационными факторами. Очевидно, что поглощение УФ-излучения белками в двух последних областях длин волн имеет весьма сложную природу.

Поскольку полоса поглощения тирозиновых остатков претерпевает заметный сдвиг с ростом рН благодаря ионизации фенольных групп, а в случае остатков триптофана такой сдвиг не имеет места, спектрофотометрический метод можно использовать для оценки числа этих остатков в белках. Во многих белках обычно ионизуется лишь часть остатков тирозина, в то время как полная ионизация всех тирозинов наблюдается лишь при денатурации (разд. 4.2.1). Следовательно, изменения в спектрах поглощения могут быть использованы для оценки изменений в химическом окружении ароматических остатков и конформационных изменений в белках в целом. Изменение состояния белка и его хромофоров удобно исследовать путем снятия дифференциальных спектров, т. е. путем прямой регистрации разности поглощения белка при двух различных условиях, например при изменении рН. добавлении мочевины и т. д. Изменения в дифференциальных спектрах нативных и денатурированных белков обычно в ~ 10 раз выше в области 230 нм, чем в области 280 нм.

6.8.2. Оптическое вращение белков

Растворы всех белков способны вращать плоскость поляризации света, проходящего через них. Это происходит, в частности, вследствие присутствия в молекулах белков остатков оптически активных аминокислот. В то же время изучение даже сравнительно простых молекул показывает, что знак и величина оптического вращения зависят не только от природы атомов и групп, связанных с асимметрическими атомами углерода, но и от взаимного расположения асимметрических углеродных атомов. Отсюда следует, что изменение в структуре или конформации белковых молекул может отражаться на величине его удельного вращения.

Удельное оптическое вращение белков всегда отрицательно и для глобулярных белков лежит в области от —30 до —50°. Например, удельное вращение [ci]d растворов овальбуыина с рН 3,5 до 11 равно приблизительно —30°, хотя эффективный заряд молекулы изменяется при этих рН от +20 до —30. Следовательно, ионизация молекулы мало или совсем не влияет на ее удельное вращение. Однако при более высоких или более низких рН значение удельного вращения становится более отрицательным. Например, при рН 13 [a]D равно около —60°. Аналогично в 8 ? растворе мочевины [a]D=—85°. Такое же увеличение отрицательного удельного вращения белков наблюдается и при повышении температуры. Если возрастание отрицательного вращения белков не сопровождается разрывом пептидных связей, оно всегда свидетельствует об изменении конформации белка, в основе которого лежат изменения в его вторичной и третичной структурах.

202

1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Рис. 6.18. Дисперсия оптического вращения в УФ-области для спиральной конфигурации поли-а-L-глутаминовон кислоты в воде при рН 4,3 (/) и конформации упорядоченного клубка для ее натриевой соли при рН 7,1 (2). На оси ординат отложены величины оптического вращения на один аминокислотный остаток. [Blout ?. R., Schmier I., Simmons N. S., J. Am. Chem. Soc, 84, 3193, 1962.]

180 200 220 240 260 280 ?, нм

6.8.3. Дисперсия оптического вращения

Этот метод, основанный на изменении оптического вращения с изменением длин волн монохроматического света, дает дополнительную информацию о структуре белка. Для синтетических полипептидов, таких, как поли-Ь-глутами-иовая кислота, кривые дисперсии различны для конформации неупорядоченного клубка, образующегося при рН 7 и спиральной конформации, образующейся при рН 4,3 (рис. 6.18). Различие кривых дисперсии обнаружено также для нативных и денатурированных белков. Для расчета процентного содержания спиральных форм в белках используются различные формулы, выведенные теоретическим или эмпирическим путем. Однако в настоящее время приходится констатировать, что такого рода методы не могут давать точных абсолютных значений, а способны лишь регистрировать изменения в содержании ?-спиральных форм у глобулярных белков, многие из которых имеют всего 0—10%, а другие — до 70—80% аминокислотных остатков в этой конфигурации. Эти методы представляют особую ценность при наблюдении конформационных переходов в белках, в то время как точное определение конформации и процента спиральное™ достигается сейчас лишь на основе данных рентгеноструктурного анализа.

6. БЕЛКИ. III.

203

6.8.4. Круговой дихроизм

Этим методом измеряется разность в поглощении левого и правого цирку-лярно-поляризованных лучей света. В области оптически активных полос поглощения кривые дисперсии оптического вращения н кругового дихроизма имеют характеристические экстремумы, показанные на рис. 6.19. Оба явления, иллюстрирующие как неравные скорости пропускания света (дисперсия оптического вращения, ДОВ), так и неодинаковое его поглощение (круговой дихроизм, КД). получили название эффектов Коттона. Такого рода эффекты Коттона в простых белках ассоциируются с наличием у полипептидов полос поглощения в областях 190—240 нм (пептидная связь) и 280—290 нм (где доминируют полосы поглощения ароматических боковых цепей триптофана и тирозина). Форма и амплитуда кривых ДОВ и КД очень зависят от конформации белков, а также химического окружения хромофоров боковых цепей.

6.9. Денатурация белков

Под денатурацией понимают широкий спектр структурных изменений в белках, а также различные способы воздействия на ин-

Рис. 6.19. Теоретические соотношения оптически активных полос поглощения света и оптического вращения (а), а также оптически активных полос поглощения и кругового дихроизма (б). /?(?) —молярное оптическое вращение при длине волны ?; ? (?)—коэффициент экстинции полосы поглощения; ? (?)—эллиптичность или разность поглощения левого н правого циркулярно-поляризованных лучей света. [Beychok S., Science, 154, 1288, 1966J

204

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

дивидуальные белки. С химической точьп зрения денатурация афедставляет собой сложный процесс, а точное описание характера взаимодействия белка и денатурирующего агента, приводящего к "изменению конформации, не всегда возможно. Во всяком случае, все денатурирующие агенты в той или иной мере разрушают пе-ковалентную структуру иативного белка. Для одних белков незначительные изменения в конформации не всегда приводят к потере биологической активности, а для других даже незначительные конформационные перестройки, не всегда фиксируемые обычными методами, могут вести к полной инактивации белка.

Наиболее распространенные денатурирующие агенты — гуанн-дингпдрохлорид и мочевина. Большинство белков оказываются полностью денатурированными в водных 6—8 ? растворах гуанидингидрохлорида и в 8—10 ? растворах мочевины. В этих условиях нативная конформация обычно полностью разрушается и белок принимает конформацию неупорядоченного клубка, в которой от

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)