Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

антоиновым методом*. Для более крупных пептидов может оказаться необходимым дополнительный гидролиз другим протеолитическим ферментом. Так, пептид, полученный при расщеплении трипсином и имеющий структуру A-B-C-Tyr-E-F-G-H-Lys (где А, В, С, Е, F, G и Н —алифатические остатки типа глицина, аланина, серина и т. д.), может быть гидролизован химотрипсином по остатку тирозина с образованием пептидов А-В-С-Туг и E-F-G-H-Lys. Поскольку положение этих двух пептидов относительно друг друга уже установлено (пептид, содержащий остаток тирозина,— МН2-концевой, а пептид, содержащий остаток лизина, — СООН-концевой), дальнейшая работа по-установлению последовательности сравнительно проста.

6.2.5. Локализация дисульфидных мостиков

Положение остатков полуцистина, образующих дисульфидные-связи в белках, устанавливается в процессе выяснения полной ами-

* В настоящее время наиболее успешно используется высокоэффективная хроматография, в том числе на обращенных фазах \Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир, 19801- — Прим. ред.

6. БЕЛКИ. III.

183

нокислотной последовательности. Для белков, обладающих днсуль-фидными связями, но лишенных тиоловых групп, обычно возможно провести гидролиз нативного объекта одним или несколькими протеолитическими ферментами и выделить только цистинсодержа-щие пептиды. Наиболее подходящие для этой цели ферменты — пепсин и термолизин. Активность пепсина оптимальна между рН 1 и 4, а активность термолизина — между рН 6 и 6,5. При таких концентрациях Н+ дисульфидные связи остаются неповрежденными. Когда получен чистый цистинсодержащий пептид, его восстанавливают меркаптоэтанолом и алкилируют иодуксусной кислотой; два образованных пептида разделяют и определяют состав каж-

- - - —д-

Thr-Ser-Pro

1

I трипсин, рН 8,0; оемалеилированме; сефадекс G-50

*~ и

» * I

T|..:-Ser-Pro-Glr Arg Glx Ala-Thr Lys-Lys-Arg

12 3 4 5 6 7 8 42 43 44

трипсин, рН ll,Oj

сефадекс G-50

* I-B

I-A

Glx-Ala

Ile-Tyr

Lys

18 19 20

трипсин, рН 8,0j сефадекс G-25

I-B-2

I-B-l

Glu-Ala-Thr-Cys (Ae) Thr-Ser-Glu-Val-Ser-ay-CyslAel-Pro-Lys

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

ct-химоглрисин, рН 8.0; сефадекс G 50

трипсин, рН ?,?; сефадекс G-50

II-A

—t II-B

Leu-Ile-Gln-Lys Ser-Gly-Pro-Cys (Ae)

45 Г

49 50

51 52 53 54 55 56 I ?. NaOH, 23"C,24 ч

¦ 4

5

1

II-A-2 ?-?-1

пира л ma ———__— IS Thr-Pro-Val-Leu-Ik-GIn-Lys

45

46 47 48 49 50 51 52

I-A-l

Пе Tyr

19 20 __ on 31

трипсин^рН 8,0;

сефадекс G-25;

дауэкс ЬО -X2

I-A-l-P

даиэкс 50-?2

I-A-2

~1

I-A-3

Ser-Asn-Glu-Cys fAe) - Val-Leu Cys(Ae)-Ser-Glu-Asri-Lys

Ile-Tyr-Asn-Pro-Val-Cys(Ae) 19 20 21 22 23 24

» 32 33 34

I-A;1-Qy-Thr-Asp-Gly-Ile-Thr-Tyr

36 37

39 40 41 44

25 2f. 27 2 8 29 30 31

Рис. 6.3. Диаграмма избирательного ферментативного расщепления и определения аминокислотной последовательности маленл-5-2-аминоэтилцнстеинилпроизводного ингибитора I свиного панкреатического трипсина. Стрелками над аминокислотными остатками отмечены результаты деградации по Эдману (—»·) и расщепления «арбоксипептидазами А и В (-<—). Перечеркнутые стрелки (-«-?—.—Х-*-) указывают на безуспешные попытки исследовать пептид методом, обозначенным соответствующим направлением стрелки. Glx — либо остаток глутамина, либо остаток глутаминовой кислоты. [Bartelt D. С, Greene L. ]., J. Biol. Chem., 246, 2218, 1971.]

184

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

NHj,

Рис. 6.4. Полная аминокислотная последовательность ингибитора I свиного панкреатического трипсина с указанием положения дисульфидных связей. [Guy 0.г Shapanka R., Greene ?. J., J. Biol. Chem., 246, 7740, 1971.]

дого из них. Поскольку известна аминокислотная последовательность в районе каждого остатка полуцистина, легко понять, какие именно два остатка образуют дисульфидную связь. Цистинсодер-жащие пептиды не должны подвергаться действию щелочей или очень сильных кислот, так как дисульфидные связи могут разрушаться и в образующихся продуктах может происходить дисульфидный обмен. В том случае, когда и тиоловые группы, и дисульфидные связи присутствуют в одной и той же молекуле, можно установить, какие именно остатки полуцистина образуют дисульфидные мостики, предварительно проведя реакцию белка в денатурирующих условиях с 14С-иодацетатом, алкилирующим все свободные тиоловые группы и не затрагивающим дисульфидные связи. И дисульфиды, и свободные тиоловые группы могут быть затем локализованы в аминокислотной последовательности, как описано выше.

6.2.6. Аминокислотная последовательность ингибитора I свиного панкреатического трипсина

Описанные выше методы анализа использовались для установления аминокислотных последовательностей многих белков. Чтобы проиллюстрировать применение этих методов на одном белке относительно небольшого размера, на рис. 6.3 приведена общая схема установления последовательности белкового ингибитора панкре-

6. БЕЛКИ. III.

185

этического трипсина. Белок прежде всего восстанавливали мер-каптоэтанолом и аминоэтилировали. S-Аминоэтилированный белок обрабатывали малеиновым ангидридом с целью защиты аминогрупп лизина и S-аминоэтилцистеина, а затем расщепляли трипсином. Полученные пептиды»разделяли с помощью гель-фильтрации. Ход дальнейшего анализа последовательности, включая методы частичного гидролиза и разделения пептидов, также показан на рисунке. Окончательный вариант аминокислотной последовательности с правильным расположением дисульфидных мостиков представлен на рис. 6.4.

6.3. Конформация белков

В настоящее время изучена конформация многих белков. Первая работа, в которой сообщалось об установлении полной трехмерной структуры белка (а именно миоглобина кашалота), опубликована в 1961 г. Конформация миоглобина была выяснена с помощью реитгеноструктурного анализа его кристаллов. Этот метод и в настоящее время представляет собой уникальное средство, позволяющее получать данные о пространственном расположении атомов в молекуле белка. Однако точность кристаллографического метода структурного анализа белка пока не достаточна для того, чтобы устанавливать конформацию белка без знания его аминокислотной последовательности. Последнее весьма существенно при интерпретировании кристаллографических данных.

В этом разделе рассмотрен метод реитгеноструктурного анализа, а также представлены основные типы вторичных и третичных структур, обнаруженных в глобулярных белках. Здесь же обсуждаются методы исследования некоторых общих конформационных свойств белков.

6.3.1. Рентгекоструктурный анализ белков

Рентгеновские лучи имеют длины волн, соизмеримые с межатомными расстояниями. При изучении структуры белков часто используется рентгеновское излучение с длиной волны 0,1542 нм, возникающее при облучении электронами атомов меди. При попадании рентгеновских лучей на атом происходит их рассеяние (отражение), пропорциональное числу электронов, окружающих атом. Таким образом, дифракция рентгеновских лучей тяжелыми атомами, обладающими более высокими атомными номерами, гораздо интенсивнее, чем легкими атомами. Любой кристалл можно рассматривать как трехмерный образец, в котором электронная плотность наиболее высока вблизи центров атомов и характеризуется низкими значениями или близка к нулю между атомами.

186

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Рис. 6.5. Рентгенограмма кристаллического миоглобина кащалота. Рефлексы образуют регулярную симметричную двумерную решетку. Приведена только часть рентгенограммы. (С любезного разрешения д-ра Джона Кэндрью.)

На рис. 6.5 представлена типичная рентгенограмма кристаллического белка. Дифракционная картина представляет собой набор' пятен, образующих регулярную двумерную решетку. Легко заметить, что существует определенная симметрия в характере расположения пятен на рентгенограмме. Рентгенограмму получаютг следующим образом: небольшой кристалл белка в определенной ориентации помещают на пути тонкого пучка монохроматических рентгеновских лучей. При прохождении через кристалл лучи рассеиваются и попадают затем на фотопластинку, помещенную за кристаллом. Приведенная на рис. 6.5 картина представляет собой двумерную решетку, поскольку фотография была сделана в одной' плоскости, в то время как сам кристалл является трехмерным. Сопоставляя дифракционные картины на фотографиях, сделанных № различных плоскостях, можно составить представление о пространственной структуре молекулы. Имея серию рентгенограмм, подобных приведенной на рис. 6.5, можно измерить интенсивность рефлексов и расстояния между ними, что позволяет при соответствующей математической обработке этих данных построить карты электронной плотности. Такие карты в известном приближении характеризуют общую конформацию молекулы и позволяют при более точном анализе выяснить расположение в пространстве каждого тяжелого атома в молекуле белка (при условии, что известна его» аминокислотная последовательность).

6. БЕЛКИ. III.

187

6.4. Вторичная структура

6.4.1. Геометрия пептидной связи

Детальному изучению пространственной структуры белков предшествовал рентгеноструктурный анализ аминокислот и простых пептидов с целью точного определения длин связей и углов между ними в этих соединениях. Обнаружено, что длина связи С—N в пептиде гораздо меньше, чем во многих других соединениях. Это обстоятельство указывает на особый характер пептидной связи, которая частично обладает свойствами двойной связи, и вращение вокруг нее заторможено по сравнению с другими типами связей (N—Са и С—Са), образующих остов полипептидной молекулы. Пептидная связь является планарной и жесткой; она обладает цис- или транс-конфигурацией относительно ?-углеродных атомов, расположенных по обе стороны от этой связи. Однако транс-конфигурация более предпочтительна, поскольку она менее стерически затруднена R-группами, чем г;ис-форма. На рис. 6.6 представлена пептидная группа в транс-конфигурации с указанием длин связе

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)