нормального белка электрофоретическую или хроматографическую подвижность (рис. 6.1).

Методы идентификации ЫНг-концевых остатков, обсуждаемые ниже, представляют собой другое мощное средство для выяснения вопроса об идентичности аминокислотных последовательностей полипептидных цепей субъединиц. Неидентичность двух цепей инсулина очевидна (см. табл. 6.2), поскольку на 1 моль инсулина приходится по 1 молю гШг-концевых глицина и фенилаланина. В про-

6. БЕЛКИ. III.

173

гемоглобин А гемоглобин S

а б

Рис. 6.1. Пептидные карты гемоглобинов человека. Триптические гидролизаты гемоглобина А и гемоглобина S человека были нанесены в стартовые точки на листах фильтровальной бумаги; затем был проведен электрофорез в одном направлении и хроматография — в другом. Пептидные карты гемоглобина А (а) и гемоглобина S (б) были проявлены нингидрином. Нативный гемоглобин содержит 56 остатков лизина и аргинина (табл. 6.1). Поскольку на карте обнаруживается только двадцать шесть пептидов, белок, по-видимому, содержит 2 типа пептидных цепей с различными аминокислотными последовательностями. Если бы все четыре цепи имели идентичные последовательности, было бы обнаружено 15 пептидов, тогда как, если бы все цепи были различными, можно было бы ожидать образования ~60 пептидов. Единственная аминокислота, отличающая гемоглобины А и S, находится в пептиде 4. [Schroeder W. ?., The Primary Structure of Proteins, Harper & Row, Publisher, Incorporated, New York, 1968.]

тивоположиость этому в глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназе, содержащей четыре идентичные цепи, определяется 4 моля NH2-концевого валина на 1 моль белка. Факт обнаружения одного NH2-концевого остатка сам по себе, конечно, не является гарантией идентичности субъединиц; известны примеры, когда в белке имеются цепи с одинаковыми ЫН2-концевыми остатками, но с различными аминокислотными последовательностями, например две различные цепи гемоглобина имеют в качестве ЫН2-концевого остатка валнн.

6.1.2.1. Методы идентификации N Нг-концевых остатков

Один из методов основан иа использовании реагента, взаимодействующего с аминогруппами белка и не удаляющегося при последующем гидролизе. Установлено, что 2,4-дииитрофторбеизол (ДНФБ) — подходящий реагент для обнаружения и индентификации КН2-концевых остатков. Реагент взаимодействует с а- и ?-аминогруппами с образованием окрашенных в желтый цвет динитро-фенильных производных (ДНФ-производных), а также с некоторыми другими

174

I. основные компоненты клетки

боковыми группами аминокислот (имидазольной, феиольной, тиольной), образуя,, однако, при этом неокрашенные ДНФ-производные. Ниже приведена реакция. ДНФБ с аминокислотой:

OR _ R F + H2NCHCOOH -U2iU 02N / \ NHCHCOOH + NaF N02 NO,

Реакция с белком проводится в слабощелочной среде, затем избыток реагента удаляют и белок гидролизуют в 6 н. НС1. Окрашенные в желтый цвет ДНФ-аминокислоты экстрагируют неполярным растворителем, например хлороформом* или эфиром, и разделяют хроматографически. Поскольку после экстракции» а-ДНФ-аминокислот ?-ДНФ-лизин остается в водной фазе, можно количественно определить содержание ?-аминогрупп.

Другой химический метод определения гШ2-концевых остатков — цианатный метод. При обработке пептидов цианатом в слабощелочном растворе образуется карбамоильное производное.

О

¦? II н г HNCO + H2N—CHR —С—?—CHR · · ¦ ->

? ? t ° ft , ~° HN^SiH >?,?—С—?—CHR —С—?—CHR - · ¦ -????* I I .+ +H3N-^4R2

О—С C-K ?

Нагревание карбамоильного производного в слабой кислоте приводит к отщеплению гШ2-концевого остатка в виде гидантоина, который может быть легко выделен и после кислотного гидролиза идентифицирован в виде свободной аминокислоты.

Другой подход основан иа использовании реагента, образующего с ??^???-цевым остатком производное, которое можно затем отщепить, не гидролизуя остальную часть пептидной цепи. С этой целью успешно применяется! реагент Эдмана — фенилизотиоцианат (ФИТЦ).

? О HR'O HR'"0 ,тад„Я|-C6H5-N=C=S + H2NCHC-NCHC-NCHC ...

фенилизотиоцианат

? S ? R' ? HR'O HR'"0

?, il ? ? ii 11 ii 11 ii ssr,

-N—C—N—CH—C—NCHC—NCHC · ·.

г:

кислот

фенилтиокабрамоилпроизводиое (фТК - производное) пептида (или белка)

S

R'O HR'O

N.^ I II II 1

С + H,NCHC—NC

? R' Фен идти огидангпоин

6. белки. III.

175

На первой стадии образуется ФТК-производное пептида (или белка), которое затем подвергается действию слабой кислоты (стадия 2) при комнатной температуре. При этом отщепляется фенилтиогидантоиновое производное (ФТГ-про-изводное) NH2-KOHUCBoft аминокислоты, а пептид укорачивается на один остаток.

Для проведения последовательной деградации по Эдману часто используют автоматический прибор. При благоприятной ситуации с его помощью может быть пройдено от 40 до 50 «шагов». После каждого шага отщепленный фенилтиогидантоин должен быть идентифицирован с использованием тонкослойной или газожидкостной хроматографии или подвергнут кислотному гидролизу с последующей идентификацией регенерированной аминокислоты.

Чувствительный метод идентификации ЫНг-концевого остатка основан на применении дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорида). Благодаря интенсивной флуоресценции дансильных групп можно обнаружить и определить минимальные количества дансиламииокислот.

N

+ ?,?—К ¦

o=s=o

I

?

дансилхлорид пептид

+ аминокислота

o=s=o I

HN— R дансилпептид

o=s=o I

HN—СН—СООН R

дансил аминокислота

Дансильный метод часто используется в сочетании с деградацией по Эдмаиу. После отщепления каждого аминокислотного остатка пробу с пептидом (алик-вотную часть) подвергают действию дансилхлорида для выяснения (обычно с помощью тонкослойной хроматографии) природы следующего остатка.

Помимо химических методов определения МНг-концевых остатков применяют также ферментативный метод. Используемый при этом фермент лейцинами-нопептидаза функционирует при наличии у пептида свободной концевой а-ами-погруппы. Следовательно, от пептида, имеющего последовательность ??2—A-B-C-D..., где А, В, С, D — различные остатки, под действием этой ами-нопептидазы будут последовательно отщепляться свободные аминокислоты. В любой момент времени количество отщепленной аминокислоты А больше, чем В, а количество В больше, чем С, и т. д. Таким образом, по скорости отщепления аминокислот можно постулировать последовательность ABC. Лейцинамино-пептидаза наиболее быстро отщепляет концевой остаток лейцина, однако она действует также и на все другие остатки, имеющиеся в белках, и не расщеп' ляет лишь связь X—Pro (табл. 6.3).

Ступенчатая деградация белка по методу Эдмана или применение амино-пептидазы (или карбоксипептидазы, см. ниже) могут дать убедительные результаты только при исследовании единичной пептидной цепи или белка, содержащего несколько одинаковых цепей.

Во многих белках число свободных ?-аминогрупп соответствует числу пептидных цепей. Тем не менее известны белки, не имеющие свободной аминогруппы, например цитохром с, овальбумин и белок вируса табачной мозаики. Концевая ?-аминогруппа у большинства таких белков ацетилирована. В некоторых белках концевым является остаток пирролидоикарбоновой кислоты (пироглут-амнновой кислоты). Этот остаток ие содержит свободной аминогруппы, он лег-

Таблица 6.3

Специфичность некоторых протеолитических ферментов

ПротеолитнческнЯ фермент

Трипсин

Химотрипсин

Эластаза

Пепсин

Карбоксипептидаза А

Карбокснпептидаза В Карбоксипептидаза ? Лейцинамннопептидаза

Папаин

Субтнлизин Термолизин

Источник

Основные места действия'

Прочие места действия

Поджелудочная железа

Слизистая оболочка желудка

Поджелудочная железа

» »

Дрожжи

Почки, слизистая оболочка кишечника и т. д. Папайя

Bacillus subtilis

В. thermoproteolyticus

Стафилококковая протеаза Стафилококки

Arg, Lys Trp, Phe, Туг

Нейтральные алифатические остатки

Trp, Phe, Туг, Met, Leu

С-Концевая связь остатков Туг, Trp, Phe и т. д. С-Концевые Arg, Lys С-Концевая связь ЫН^-Концевая связь различных остатков Arg, Lys, Gly

Ароматические и алифатические остатки Связи, образованные аминогруппами алифатических остатков Glu

Не расщепляет X—Pro6 Leu, Met, Asn, His

Кислые, а также некоторые другие аминокислотные остатки

Не расщепляет по Arg,

Lys, Pro

Нет

Все остатки, но Gly слабо Не расщепляет связь X—Ргов

Широкая специфичность; не расщепляет по кислым остаткам

Различные аминокислотные

остатки

Ala, Phe

Некоторые связи Asp

о ?

X

о а X ? m

О

2 а о

X

и

X

-»

Ь)

m ~i

S

Место действия ферментов (за исключением карбоксипептндаз и термолизнна) обозначается остатком, которому принадлежит карбонильная группа расщепляемой пептидной связи. Например, трипсин катализирует гидролиз связей, образованных карбоксильными группами аргинина и лизина.

" X — любой другой аминокислотный остаток.

6. БЕЛКИ. III.

177

ко образуется в определенных условиях из ЫНг-концевого глутамина с элиминированием ?-амидного азота в виде аммиака:

CHj—сн2 о

HjN-c ^h—c-N--. o=c- Jn—c-N- +1

? nh2 nh

NH2-KOHueBoii остаток остаток пироглутаминовои

глутамина кислоты

6.1.2.2. Методы идентификации СООН-концевых остатков

Химический метод идентификации остатков, несущих ?-карбоксильные группы, основан на реакции белка (или пептида) с гидразином в безводной среде при 100 "С. При расщеплении пептидной связи с помощью гидразинолиза в гидразиды аминокислот превращаются все аминокислотные остатки, кроме СООН-концевого, который остается в виде свободной аминокислоты и может быть выделен и идентифицирован с помощью хроматографических методов:

nH2NCHRCONHNH2 + аминокислота

Ферментативный метод заключается в использовании панкреатических карбоксипептидаз. Карбоксипептидаза А отщепляет от белка или пептида только тот остаток, который несет свободную ?-карбоксильную группу. По аналогии с методом, в основу которого положено расщепление белка аминопепти-дазой (разд. 6.1.2.1), информацию, касающуюся СООН-концевой последовательности, можно получить