компонентов сложных смесей. Эти же методы часто оказываются полезными для уста-

11·

164

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

новления степени чистоты веществ. Обычным критерием чистоты низкомолекулярных веществ биологического происхождения является сохранение физических констант и элементного состава после повторных очисток. Хорошие результаты получают при использовании одного или более «каскадных» методов. Чистоту низкомолекулярных ионных соединений можно оценить, например, с помощью зонного электрофореза, ионообменной хроматографии или хроматографии на бумаге, а неионных веществ — с помощью хроматографии на бумаге, адсорбционной или газожндкостной хроматографии.

Обычные критерии, принятые для оценки чистоты низкомолекулярных веществ, малоприменимы к белкам, нуклеиновым кислотам и полисахаридам. Эти макромолекулы плохо кристаллизуются и могут образовывать смешанные кристаллы с другими соединениями; они, как правило, не имеют определенной точки плавления. Определение элементного состава в этом случае не имеет смысла вследствие наличия огромного числа атомов в макромолекулах. Однако что касается белков, то число остатков каждой аминокислоты, рассчитанное на молекулу индивидуального белка, должно быть целочисленным; следовательно, когда в молекулу белка входит небольшое число остатков какой-либо аминокислоты, аминокислотный анализ дает ценную информацию о гомогенности белка.

Непосредственных способов определения чистоты макромолекул не существует; для этих целей используются методы обнаружения примесей, т. е. доказательства негомогенности образца. Считается, что вещество является чистым, если ни один из возможных методов не выявляет его негомогенность. Для обнаружения примесей прежде всего используются каскадные методы.

Гомогенность образца по молекулярной массе может быть установлена с помощью методов ультрацентрифугирования или гель-фильтрации. Но эти методы менее чувствительны по сравнению с каскадными методами, в которых разделение макромолекул зависит от их суммарного заряда. Для установления чистоты белков, пептидов и олигонуклеотидов очень полезны методы зонного электрофореза, особенно при изучении электрофоретического поведения образца в нескольких буферных системах с различными значениями рН. С помощью ионообменной хроматографии также можно обнаружить присутствие примесей. Распределительная хроматография и противоточное распределение были успешно использованы при изучении лишь немногих белков из-за ограниченной растворимости и относительной нестабильности большинства белков в неполярных растворителях. Чистоту пептидов, содержащих до 40— 50 остатков аминокислот, можно во многих случаях установить с помощью хроматографии на бумаге. Часто макромолекулярное вещество, кажущееся гомогенным при исследовании одним методом, оказывается негомогенным при использовании другого метода. На-

5. БЕЛКИ. II

165

пример, по результатам ультрацентрифугирования присутствующие в растворе молекулы белка имеют одинаковые размеры и форму, а согласно данным электрофореза, в растворе имеются примеси. При определении чистоты любого вещества следует применять методы, основанные на различных свойствах молекулы, таких, как размер, заряд, растворимость и т. д.

Многие белки обладают специфическими функциональными свойствами: одни являются гормонами, другие —ферментами, третьи — переносчиками кислорода и т. д. Методы обнаружения белков, основанные на их специфических функциональных свойствах, являются чрезвычайно чувствительными, поскольку наличие очень небольших количеств таких белков может быть зафиксировано по физиологическому действию, каталитической активности и т. п.; если препарат белка обладает рядом каталитических-или других функций, за которые отвечает единственный белок, то» дополнительная очистка или частичная инактивация белка не должна изменять соотношения функциональных активностей. Например, если ферментативный препарат действует на вещество А в 10 раз быстрее, чем на В, а при повторной очистке фермента отношение изменяется от 10: 1 до 100: 1, то этот факт свидетельствует о том, что за два каталитических эффекта ответственны разные ферменты.

Критерий функциональной гомогенности благодаря высокой чувствительности самого теста является одним из наиболее важных при исследовании белков. Часто оказывается возможным зафиксировать с помощью теста на функциональную активность наличие примесей, присутствующих в крайне низких концентрациях (одна часть примеси на несколько тысяч или миллионов частей основного белка). Такая чувствительность намного превышает чувствительность большинства физических или химико-аналитических методов.

Большинство белков, а также некоторые полисахариды и липиды обладают свойствами антигенов, т. е. они стимулируют образование специфических антител после инъекции подопытному животному. Инъекция индивидуального вещества вызывает образование антител одного типа, тогда как смесь антигенных веществ вызывает образование нескольких типов антител. Этот биологический метод установления гомогенности белковых препаратов может быть таким же чувствительным, как методы, основанные на детекции по энзиматическому или гормональному действию, при условии, что примеси обладают антигенными свойствами.

Количество белка-антигена в растворе можно определить путем добавления специфической антисывороткн (гл. 30) с последующим отделением образующегося осадка и определением его количества любым доступным методом.

См. литературу к гл. 6.

Глава 6

БЕЛКИ. Ill

Аминокислотная последовательность и конформация белков

Принято рассматривать четыре уровня структурной организации белков. Термин первичная структура относится к аминокислотной последовательности и используется часто наряду с термином ковалентная структура. Термин вторичная структура характеризует различные типы регулярных структур, встречающихся во многих белках, например спиральные структуры (?-спирали), образованные единичной полипептидной цепью, и складчатые листы (?-струк-туры), образованные двумя или несколькими участками цепи. Термин третичная структура характеризует конформацию белка в целом, его пространственную структуру. Термин четвертичная структура относится к пространственному взаиморасположению субъединиц белка, если таковые существуют. Вторичную, третичную и четвертичную структуры в совокупности часто называют некова-лентной структурой.

6.1. Первичная структура

6.1.1. Аминокислотный состав

Прежде чем определять аминокислотную последовательность белка, необходимо установить его аминокислотный состав. При этом можно использовать различные методы (разд. 4.1.3.3 и след.). Наиболее широко применяемый в настоящее время количественный метод аминокислотного анализа белкового гидролизата основан на использовании ионообменной хроматографии (разд. 5.6.3.3 и след.). Белок обычно гидролизуют в 6 н. НС1 при 100°С в течение 20 и более часов в отсутствие воздуха. Как правило, проводят несколько параллельных опытов с различной продолжительностью гидролиза; при этом удается оценить скорость разрушения лабильных аминокислот, таких, как серии, треонин и тирозин, а также добиться полноты гидролиза наиболее стабильных пептидных связей, особенно образованных остатками изолейцина и валина. При кислотном гидролизе разрушается триптофан; его можно опреде-

6. БЕЛКИ. III.

167

лить спектрофотометрическими методами. Глутамин и аспарагин превращаются в соответствующие дикарбоновые кислоты; однако амиды могут быть определены после исчерпывающего гидролиза протеолитическими ферментами или непосредственно при установлении аминокислотной последовательности. Содержание цистеина и цистина в белках трудно оценивать количественно при исследовании гидролизатов обычными методами, поскольку эти остатки частично разрушаются при кислотном гидролизе, плохо разделяются в ходе ионообменной хроматографии и слабо окрашиваются нингидрином. Суммарное содержание цистеина и цистина можно» точно определить двумя методами. Ниже приведены соответствующие схемы реакций:

Нг/ />=0

H^C-CH.-S-S-CH.-CH + HS-CH2-CH2-OH 6М п~™Яро-

о=с^ >ч

белок ?-меркаптоэтанол HNlf

-- 2 HC-CH2-SH + HO-CH,-CH=-S-S-CH,-CH..OH

о=с

/

??

НС—CH,-SH + 1—сн,—соо

о=с/ *

ч

белок

СООН

i

сн. I "

S

/ I HN СН,

HC-CH2-S-CH2-COO ?.,?-С-СООН

о=с ¦ ' ?

Б-карбоксимегпилцистрин

Нг/ О

ч

НС—СН2—SH (или дисульфид) + НС—ООН

q —С_ кислой ^

белок

SO.?

HN^ СН, HC-CH.-SOjH > ?,?-C-CO..H

o=c H

4,1 цистеиновая

кислота

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Если обработать белок избытком надмуравьиной кислоты, то остатки цистеина и цистина окисляются до остатков цистеиновой кислоты. При полном гидролизе цистеиновая кислота освобождается почти количественно и легко определяется с помощью ионообменной хроматографии. В другом методе днсульфидные связи восстанавливают избытком меркаптоэтанола в 6 ? гуанпдннгнд-рохлориде; при этом образуются остатки цистеина. Последние при реакции с иодацетатом превращаются в остатки S-карбоксиметил-дистеина. S-Карбоксиметилцистеин стабилен при кислотном гидролизе в присутствии восстановителей и может быть определен путем ионообменной хроматографии.

По результатам определения содержания цистеиновой кислоты или S-карбоксиметилцистеина нельзя судить о том, присутствуют ли в белке цистеин и цистин или только один из них. Таким образом, по числу остатков цистеиновой кислоты или S-карбоксиметилцистеина судят о содержании полуцистина. Для установления соотношения между цистеином и цистином в белке можно определить содержание тиоловых групп (т. е. содержание цистеина) различными методами, например с помощью реагента Эллмана (разд. 4.1.3.3). Если известно суммарное содержание полуцистина и определено количество тиоловых групп (цистеина), можно рассчитать содержание в белке цистина.

Приведенные в табл. 6.1 данные показывают, что аминокислотный состав представленных белков существенно различается. Например, в гормоне инсулине отсутствуют триптофан и метионин, а В миоглобине — цистеин и цистин. В табл. 6.1 содержание разл