т. е. сдвигают равновесие в приведенной выше реакции влево.

Химическая природа лиганда зависит от природы выделяемого белка и способа закрепления лиганда на носителе. Если разделяют смесь ферментов, то лиганд должен быть структурно подобен либо субстратам, либо продуктам

5. БЕЛКИ. И

159

ферментативной реакции, либо конкурентным ингибиторам, поскольку специфичность связывания в этом случае обеспечивается за счет взаимодействия лиганда с активным центром фермента. Для антитела лиганд должен быть структурно родственным его антигену, для лектинов — специфическим сахарам, а для ре-цепторных белков — рецептируемым веществам. Основная проблема в создании подходящего лиганда заключается в необходимости его закрепления на носителе химическим способом, поэтому до тех пор, пока не были разработаны общие методы «привязывания» лигандов к декстранам н агарозам, аффинная хроматография не имела практического значения. При щелочных рН бромциан реагирует с декстранами и агарозами, обычно используемыми для гель-фильтрации, а образующиеся производные ковалентно связываются с первичными и вторичными аминами. Считается, что реакция бромциана со свободными гидроксид-ными группами агароз происходит следующим образом (М — гранулы агарозы):

активированная агароза

«Активированная агароза» затем взаимодействует с аминами:

Были также разработаны другие методы привязывания лигандов к различного типа матрицам, но активация агарозы бромцианом с последующим присоединением аминов остается наиболее широко используемым и гибким методом приготовления специфических адсорбентов для аффинной хроматографии. Агарозы с привязанными лигандами довольно стабильны и обладают отличными характеристиками как носители для колоночной хроматографии. Поэтому, если у специфического лиганда отсутствует аминогруппа, то ее вводят искусственно. Поскольку белки содержат свободные аминогруппы, они легко привязыва-

160

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

NR

Рис. 5.21. Выделение химотрипсина и трипсина из сока поджелудочной железы путем одностадийного специфического связывания с ингибитором обоих ферментов. Фракция NR, вышедшая с колонки после элюирования раствором с рН 3, не содержала ни трипсина, ни химотрипсина и представляла собой белки, неспецифически связанные с помощью ионных взаимодействий с ингибитором из соевых бобов. Такое связывание часто имеет место при аффинной хроматографии, поскольку многие лиганды имеют ионную природу и аффинные адсорбенты ведут себя как ионообменники. Таким образом, специфическое элюирование ингибиторами дает более высокоочищенные ферменты, чем неспецифическая десорбция путем изменения ионной силы или рН. [Porath С, Kristiansen Т., pp. 95—175, in: ?. Neurath, R. L. Hill, eds.. Proteins, vol. I, Academic Press, Inc., New York, 1975.]

ются к активированной агарозе. Агароза, к которой привязан белок — ингибитор трипсина, выделяемый из соевых бобов, является превосходным специфическим адсорбентом трипсина и химотрипсина (рис. 5.21). Оба фермента связываются с этим ингибитором в соке поджелудочной железы в условиях их каталитической активности, поэтому очень вероятно, что взаимодействие с ингибитором происходит специфически. В аффинной хроматографии адсорбцию белков обычно осуществляют в условиях, благоприятствующих максимальному специфическому связыванию. После того как большинство белков сока поджелудочной железы выйдет, не задерживаясь, из колонки, химотрипсин специфически элюируют буферным раствором, содержащим ингибитор этого фермента — трип-тамин. Затем раствором, содержащим бензамидин (ингибитор трипсина, но не химотрипсина), элюируют трипсин. Триптамин и бензамидин являются специфическими десорбентами этих ферментов, поскольку они также связываются с их активными центрами и, следовательно, способны вытеснять оттуда соевый ингибитор трипсина. Привязывание белков к агарозе нашло широкое применение для выделения других белков; например, специфические антитела на какой-либо белок-антиген адсорбируют на агарозе с привязанным антигеном, а затем де-сорбируют их, промывая колонку раствором с высокой ионной силой или низким рН.

В настоящее время более чем для 100 ферментов уже получены специфические адсорбенты, представляющие собой ковалентно пришитые к агарозе синтетические низкомолекулярные ингибиторы или субстраты. Например, гексанол-аминные производные UDP и ?-ацетилглюкозамина, структуры которых приведены ниже, способны связываться с агарозой, активированной бромцианом,

5. БЕЛКИ. II

161

образуя различные, но в равной мере эффективные адсорбенты для галактозил-траисферазы, катализирующей реакцию (гл. 15)

UDP-Gal + GlcNAc -*¦ Gal (?? ,4) GlcNAc + UDP

но он

Следует обратить внимание на то, что в обоих случаях лиганд отделен шестью метиленовыми звеньями от аминогруппы, реагирующей с агарозой. Эти звенья образуют так называемую «ножку», роль которой заключается в том, чтобы отталить лиганд от поверхности агарозы с целью устранения стерических препятствий для связывания фермента. Известно много случаев, когда для получения эффективного аффинного адсорбента требовалась даже более длинная «ножка».

5.6.4. Электрофорез

Ранее уже отмечалось, что белковые молекулы перемешаются в электрическом поле (при любом рН, кроме изоэлектрической точки). Методы, основанные на этом свойстве белковых молекул, широко используются при изучении смесей белков. По кривой титрования белка можно составить представление о суммарном электрическом заряде молекулы при любом рН. Так как скорость перемещения молекулы в электрическом поле в значительной степени определяется ее суммарным зарядом, электрофоретическая подвижность белка зависит от рН, как, впрочем, и степень ионизации молекулы. На рис. 5.22 приведены электрофоретическая подвижность и кривая титрования кристаллического яичного альбумина. Хотя форма и размеры молекулы оказывают влияние на абсолютную скорость перемещения в электрическом поле, определяющим фактором является все же суммарный заряд.

Поскольку белки значительно различаются по изоэлектриче-ским точкам и кривым титрования, они различаются также по элек-трофоретической подвижности при любом данном рН. Электрофо-ретический анализ используется для определения чистоты индивидуальных белков, а также для количественного анализа сложных смесей.

В экспериментальном отношении электрофорез довольно несложен. Белок в буферном растворе с определенным рН помещают

II—114S

162

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Рис. 5.22. Электрофоретнческая подвижность (точки) и кривая титрования кристаллического яичного альбумина. (Данные по подвижности взяты из работы [Langswarth L. С, Ann. ?. ?. Acad. Sci., 41, 275, 1941]; кривая титрования взята из работы Саппап R. К., Kibrick ?., Palmer ?. ?., Ann. ?. ?. Acad. Sci., 4t, 243,

1941].)

на дно U-образной трубки. Непосредственно на образец белка наслаивают буферный раствор, не нарушая границы между ними. В буфер опускают электроды, а U-образную трубку погружают в баню, в которой поддерживается постоянная температура около 0°С. Это делается для того, чтобы уменьшить конвекционные токи, которые могут возникать при выделении тепла, а также для предотвращения тепловой коагуляции термочувствительных белков. В современных электрофоретических приборах применяются U-об-разные трубки с плоскими оптически прозрачными поверхностями. Эти приборы сконструированы таким образом, что введение растворов в систему и температурное уравновешивание осуществляются без нарушения границы между буфером и раствором белка. Скорость движения молекул белка в электрическом поле определяется: путем измерения временной зависимости перемещения фронта белка в растворителе. За перемещением зоны окрашенного белка можно легко наблюдать визуально. Но поскольку большинство белков бесцветны, разработаны специальные оптические системы, подобные применяемым при ультрацентрифугировании (разд. 5.1.1), позволяющие следить за изменением показателя преломления раствора в электрофоретической ячейке. Зафиксированные различия значений показателя преломления в разных зонах раствора белка отражают изменения концентрации белка; другими словами, градиент показателя преломления связан с распределением и количеством растворенного вещества, в данном случае белка.

i. БЕЛКИ. II

163

'Рис. 5.23. Электрофоретическое разделение сложной смеси белков плазмы крови ¦человека (а), одиночный пик кристаллической карбоксипептидазы (б) и гомогенный пик кристаллического бычьего сывороточного альбумина (в). Вертикаль — -стартовая граница белкового раствора. Пик в начальном положении обусловлен присутствием солей буферного раствора.

На рис. 5.23 представлены электрофореграммы двух высоко-очищенных белков (бив). Там же в качестве примера разделения сложных белковых смесей приведены результаты электрофореза •образца нормальной плазмы человека (а). Чистое вещество дает ¦только один симметричный пик, имеющий форму вероятностной кривой. Асимметричность этой кривой, а также наличие нескольких пиков свидетельствуют о присутствии смеси нескольких веществ. В этом случае можно количественно оценить долю каждого из компонентов смеси, определяя отношение площади пика данного вещества к сумме площадей всех пиков.

Разделение заряженных соединений с помощью электрофореза можно проводить не только в растворе, но и в различных пористых инертных средах, таких, как крахмал, силикагель, полиакриламид-ный гель, смоченная фильтровальная бумага. Раствор смеси веществ обычно наносят в виде четкого пятна или зоны, а затем про-"водят электрофорез, добиваясь иногда полного разделения всех компонентов смеси. Этот процесс, называемый зонным электрофорезом, применяют как для аналитических, так и для препаративных целей. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия широко используют для определения молекулярных масс полипеп-тидов (разд. 5.1.7); метод иммуноэлектрофореза рассмотрен в гл. 30.

-5.6.5 Критерии чистоты

Ранее (разд. 5.6 и след.) уже рассмотрены принципы и приведены примеры использования различных каскадных методов выделения, очистки и количественного анализа