остаточно сильные кислоты и меняют цвет метилоранжа; поэтому они образуют в колонке красные полосы на желтом фоне, как показано на рис. 5.13, и их движение хорошо заметно. Каждую фракцию собирали по мере выхода из колонки. С помощью этого метода нельзя разделить все ?-ацетил-аминокислоты, однако при использовании нескольких систем растворителей и различных колонок рят. производных удалось выделись в виде препаратов вы-

5. ЕЕЛКП. ?

149

Рис. 5.13. Принципиальная схема простейшего типа хроматографии. Прежде всего готовят колонку с подходящим адсорбентом (слева). Раствор, содержащий смесь четырех веществ, наносят сверху на колонку и дают ему медленно «впитаться» в нее под действием силы тяжести или небольшого разрежения, созданного в колбе. При этом смесь адсорбируется в виде узкой полосы в верхней части колонки (в центре). При пропускании элюента через колонку сверху вниз смесь разделяется, а поскольку вещества окрашены, то в колонке появляются четыре дискретные

зоны (справа).

сокой чистоты. Основной механизм разделения на такой колонке заключается в распределении ациламинокислот между неподвижной (вода) и подвижной (хлороформ) фазами, как и в случае противоточного распределения; при этом небольшой отрезок колонки эквивалентен одной стадии противоточного распределения. Хотя некоторая адсорбция на снликагеле и влияет на подвижность кислот, метод был назван жидкостной хромотографией.

Затем в качестве твердого носителя для разделения модифицированных аминокислот стали использовать фильтровальную бумагу. Хроматография на бумаге, единственный широко применяемый в биохимии вид жидкостной хроматографии, является одним из наиболее эффективных аналитических методов разделения. Полоску фильтровальной бумаги, на которую недалеко от верхнего конца нанесено некоторое количество смеси аминокислот, насыщают водной неподвижной фазой и помещают в камеру, насыщенную парами обеих фаз; верхний конец полоски опускают в лодочку, содержащую подвижную фазу, и закрепляют в ней. Подвижная фаза под действием капиллярных сил поступает из лодочки и движется далее вниз по полоске бумаги. Индивидуальные аминокислоты перемещаются вниз по бумаге с различными скоростями, зависящими от их коэффициентов распределения для данной пары фаз (по аналогии с противоточным распределением или колоночной жидкостной хроматографией). Порядок движения аминокислот по бумаге различен в разных растворителях, и ни один из применяемых растворителей не позволяет произвести полное разделение всех 20 аминокислот, но, используя хроматографирование в двух перпендикулярных направлениях (рис. 5.14), можно добиться полного их разделения. Аминокислоты можно обнаружить, опрыскивая бумагу раствором нингидрнна, что приводит к появлению синеватых окрашенных пятен аминокислот. Описанная методика соответствует нисходящей бумажной хроматографии. Иногда в

150

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Направление 1

Яр

Рис. 5.14. Разделение смеси аминокислот с помощью двумерной хроматографии на бумаге. В первом направлении использована смесь растворителей к-бутанол — уксусная кислота — вода (250:60:250 но объему), а во втором направлении — смесь фенол — вода — аммиак (120:20:0,3%). Rf фронта растворителей в обоих направлениях принято равным 1. Сокращения названий аминокислот см. табл. 4.1.

одном или в обоих направлениях вполне успешно применяется восходящая бумажная хроматография.

Жидкостная распределительная хроматография на бумаге используется для разделения очень многих типов веществ, включая простые углеводы, липиды, нуклеотиды и пептиды. Кроме того, разработаны различные модификации этого метода, в которых целлюлоза заменена синтетическими полимерами, кремнеземом, окисью алюминия или производными целлюлозы. Для проведения хроматографии могут быть использованы самые разнообразные растворители. В одной из разновидностей этого метода, называемой тонкослойной хроматографией, смесь веществ разделяется с помощью восходящей хроматографии па твердом носителе, нанесенном равномерным тонким слоем на стеклянную или пластмассовую пластинку.

Другой метод распределительной хроматографии — газожидкостная хроматография — особенно пригоден для разделения легколетучих веществ. Первоначально применение этого метода ограничивалось разделением летучих углеводородов и жирных кислот, однако сейчас он используется и для разделения летучих производных липндов, моносахаридов, аминокислот, стероидов н других веществ, представляющих биологический интерес.

В газожидкостной хроматографии стеклянная или металлическая колонка длиной 1—2 м и диаметром 0,2—1 см заполняется тонкоизмельченными частицами инертного твердого носителя (например, днатомитовая земля или огнеупорный кирпич), пропитанными нелетучими жидкостями (смазочными или силиконовыми маслами либо полиэфирами высокомолекулярных спиртов и двух-

5. БЕЛКИ. II

151

20:5

Врегия,мин

Рис. 5.15. Газожидкостное хроматографическое разделение метиловых эфиров жирных кислот, присутствующих в нормальной плазме крови крысы в виде эфиров холестерина. Цифры у пиков указывают число атомов углерода (первая цифра) и число двойных связей в данной кислоте (вторая цифра). Площади пиков пропорциональны относительным количествам жирных кислот в смеси. (С любезного разрешения д-ра Л. Гайдеза).

основных кислот). В колонке по всей ее длине поддерживается повышенная температура (170—225 °С); смесь анализируемых летучих веществ вводится в верхнюю часть колонки и быстро там испаряется. Пары веществ проходят через колонку, увлекаемые равномерным потоком инертного газа, например аргона, гелия или азота. Компоненты смеси движутся по колонке с различными скоростями в зависимости от коэффициентов распределения между газом (подвижная фаза) и нелетучей жидкостью (неподвижная фаза). Наличие разделяемых веществ в потоке газа, выходящего из колонки, обычно обнаруживается физическими или химическими средствами. Результаты автоматически записываются на диаграммной ленте в виде серии пиков. Площадь каждого пика пропорциональна концентрации соответствующего компонента смеси. Идентификация компонентов на хроматограмме осуществляется с помощью стандартов. Проведенное таким образом разделение смеси метиловых эфиров жирных кислот представлено на рис. 5.15. Для идентификации членов гомологического ряда, например метиловых эфиров насыщенных жирных кислот с неразветвлен-ной цепью, строят график зависимости времени, необходимого для элюирования данного соединения (времени удерживания), от числа атомов углерода в молекуле. Газожидкостная хроматография позволяет проводить количественное разделение и анализ нанограммовых количеств смесей многих веществ.

5.6.3.3. Ионообменная хроматография

В этом каскадном методе раствор, содержащий смесь ионов, наносится на колонку с подходящим нерастворимым носителем, несущим фиксированные заряженные группы и находящимся в равновесии с водным буферным раствором. Затем через колонку под действием гидростатического давления (движущая сила) пропускается буферный раствор. Разделение происходит вследствие ионных взаимодействий (задерживающая сила) между растворенными веществами и носителем. Движение ионов вниз по колонке определяется природой носителя, свойствами разделяемых ионов и растворителя.

Применяются несколько типов носителей (ионитов), включая синтетические смолы, целлюлозу, декстран или агарозу, в которые введены катионные или

152

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

анионные группы. Смолы, связывающие катионы, называются катионообменными нли катионитами, а связывающие анионы — анионообменными или анионитами. В табл. 5.4 перечислены некоторые типичные иониты, производимые промышленностью.

Таблица 5.4 Некоторые широко применяемые иоииты

Катионит Анноннт Полимерный носитель Функциональная группа Полимерный носитель Функциональная группа

Сульфированный полистирол с поперечными связями

Полиметакри-ловая кислота с поперечными связями

Фосфоцеллюлоза

Карбоксиметнл-целлюлоза

Сульфопропил-декстраи

—S03H —СООН

—О—РОгН

—сн2—соон

— (СН2)г—S03H

Триэтиламино-

полистирол с поперечными связями

Диметил(окси-

метил)амино-

полистирол

с поперечными

связями

Диэтиламино-этилцеллюлоза

Диэтил(2-окси-пропил) ами-ноэтилендек-стран

-N(CH2-CH3)3

-N(CH3)2 СН2—ОН

-(CH2)2-N

^/сн2—СНз

\

сн2—сн3

-(CH2)2-N(CH2-CH3)2 СНа—СН—СНа

I

он

Принцип ионного обмена иллюстрирует схема на рис. 5.16, где рассмотрено взаимодействие двух гипотетических веществ РН+ и QH+ с катионитом, содержащим функциональные сульфогруппы. Прежде всего ионит промывают большим объемом буферного раствора, содержащего равные концентрации слабой кислоты НВ (??{=4) и ее натриевой соли (Na+B-), причем рН раствора равен 4, а концентрация ионов cNa+ 0,1 моль/л. Полученную таким способом смолу (в Na-форме) переносят в колонку в том же буфере (рН 4). Вещества РН+ и QH+ являются слабыми кислотами; каждое из веществ имеет одну кислотную группу (р7(р»=6 и pKq=7). Если РН+ и QH+ растворить в небольшом объеме буфера с рН 4 и нанести на колонку, уравновешенную тем же буфером, то РН+ и QH+ будут замещать ионы натрия на катионите. После завершения этого процесса РН+ и QH+ окажутся в неподвижной фазе, т. е. на нерастворимом катионите. РН+ и QH+ очень прочно связываются с катионитом в данных условиях (рН 4 и [Na+]=0,1 моль/л). Связывание может быть ослаблено изменением концентрации Na+ или рН раствора. Если буферный раствор подщелачивать до рН -6, соединение РН+ начнет частично диссоциировать, образуя Р, которое плохо связывается с обменником. При еще более щелочных рН будет образовываться Q, также плохо связывающееся с носителем. Напротив, если значительно увеличить концентрацию Na+, например от 0,1 до 0,5 моль/л, поддерживая рН 4, то как РН+, так и QH+ будут менее прочно связываться со смолой, поскольку большее число ионов Na+ окажется способным конкуриро-

5. БЕЛКИ. ?

153

Рис. 5.16. Принципиальные особенности ионного обмена. Частица катионообмен-иой смолы изображена в виде большой окружности, а — смола имеет фиксированные отрицательные з