угодно малую длину канала можно рассматривать в качестве отдельной стадии каскадного процесса.

В табл. 5.3 перечислены некоторые обычные каскадные методы разделения смесей биохимических веществ, а также проведена классификация каждого метода на основании природы движущей и задерживающей сил, действующих при разделении. Методы ультрацентрифугирования, описанные выше, также принадлежат к каскадным методам.

5.6.2. Противоточное распределение

Разберем в качестве примера типичного каскадного метода разделения процесс противоточного распределения. Этот метод заключается в повторяемом распределении смеси растворенных веществ между двумя несмешивающимися растворителями в серии пробирок или делительных воронок, в которых иесмеши-вающиеся фазы находятся в контакте. Для иллюстрации использования этого метода рассмотрим поведение растворенного вещества прн последовательном распределении между двумя несмешивающимися жидкостями в нескольких делительных вороиках. Распределение вещества между двумя несмешивающимися растворителями определяется его коэффициентом распределения /Ср."

концентрация вещества в верхней фазе р концентрация вещества в нижней фазе

При Кр= I после растворения вещества в любом из двух растворителей и после тщательного перемешивания фаз количество вещества в верхней и нижней фазах будет одинаковым (при условии, что объемы фаз одинаковы). При последовательном переносе вещества в следующие делительные воронки с соблюдением принципа противотока (рис. &.II) будет достигаться новое распределение между верхней и иижией фазами в каждой воронке. В этом процессе нижняя фаза остается неподвижной и потому так и называется неподвижной фазой, тогда как верхняя переносится и называется подвижной фазой. По завершении определенного числа переносов вещество будет распределено по ряду пробирок в зависимости от его коэффициента распределения и числа переносов. Таким образом, при 100-кратном переносе вещества с коэффициентом распределения 1 максимальное количество этого вещества будет сконцентрировано в 50-й пробирке, все более уменьшаясь в обе стороны от этой пробирки, так что реальное распределение этого вещества будет соответствовать распределению Пуассона, как показано на рис. 5.11,6. Вещества с /Ср<1 будут распределяться в пробирках 1—'50, а вещества с КР>1 —в пробирках 50—100.

Каждая пробирка в приборе для противоточного распределения может рассматриваться как отдельная стадия каскадного процесса разделения, в котором растворенные вещества переносятся от одной стадии к другой механически (движущая сила Fi) и задерживаются в зависимости от их коэффициентов распределения (задерживающая сила /-г). Два соединения с различными коэффициентами распределения могут быть разделены после достаточного числа переносов, причем число таких переносов зависит от абсолютной разности коэффициентов распределения. Для разделения веществ с незначительно отличающимися коэффициентами распределения (например, 0,06 и 0,1) потребуется гораздо больше переносов, чем для разделения веществ с большей разностью Кр-

В настоящее время противоточное распределение широко применяется в биохимии, хотя и не является столь общепринятым, как другие каскадные ме-

Таблица 5,3 Классификация методов разделения3

Метод

Движущая сила Fi

Задерживающая сила Fj

Факторы, влияющие на разделение

Противоточное распределение

Хроматография Адсорбционная

Распределительная жидкостная

Распределительная газо-жидкостиая

Ионообменная Гель-фильтрация

Механическая

Силы, определяющие характер Растворимость в иесмешиваю-распределеиия между фазами щихся растворителях

Гидродинамическая Поверхностная энергия адсорб- Структурные особенности раз-ции деляемых веществ и адсорбен-

тов

> Силы, определяющие характер Растворимость в несмешиваю-

распределения между фазами щихся жидкостях

Механическая Гидродинамическая

То же

Электростатическая

Аффинная

Электрофорез В свободном растворе

В пористых средах (зон ный электрофорез)

В пористых средах в при сутствии детергентов

Электростатическая

Растворимость газообразных веществ в жидкой фазе

Ионная природа ионообменни-ка и разделяемых веществ

Силы, определяющие характер Различия в размерах и форме распределения между фазами молекул растворителя внутри и вне гранул носителя

Нековалентные взаимодейст- Специфические взаимодействия вия

Молекулярное трение > »

растворенных веществ с адсорбентом

Ионные свойства

» > » Молекулярные массы

Нз книги Morris С. J.O. R., Morris P., Separation Methods in Biochemistry, Pitman Publishing Corporation, New York, 1976.

№1

№2

50

50

? ? ? о

25 25

25 25

0 1 2 1 0

№3 12,5 25 12,5

12,5 25 12.5

N'4

№5

№7

8 7 6 5 4 3 2 1 0

6,25 18.7 18.7 6,25

6,25 18,7 18,7 6,25

0 1 2 3 4 5 6 7 6

8 7 6 5 4 3 2 1 0

3.1 12.5 18.7 12,5 3,1

3,1 12,5 18,7 12.5 3,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

8 7 6 5 4 3 2 1 0

1,5 7,8 15,6 15.6 7,8 1.5

1.5 7.8 15.6 15,6 7.8 1,5

0 1 2 Э 4 5 6 7 8

8 7 6 5 4 3 2 1 0

0.75 4,7 11.7 15,6 11.7 4.7 0,75

0,75 4,7 11.7 15.6 11.7 4.7 0,75 1 1

0 1 г 3 4 5 6 7 8

8 7 6 5 4 3 2 1 0

С. 38 2.7 8,2 13,7 13.7 8,2 2.7 0.38

0,38 2.7 8.2 13.7 13.7 8,2 2,7 0.38

0 1 2 3 4 5 6 7 8

№9

Общее количество растворенного вещества в пробирке

0,19 1.5 5.5 11 13.7 11 5.5 1.5 0,19

0,19 1,5 5,5 11 13,7 11 5.5 1.5 0,19

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0,38 3 11 22 27,4 22 11 3 0,38

Рис. 5.11. Противоточное распределение вещества с /Ср=1,0 между равными объемами двух несмсшивающихся жидкостей, а — первая стадия: 100 мг вещества помещают в пробирку № 0; фазы перемешивают н оставляют до полного разделения. Поскольку Кр= I, то в обеих фазах будет по 50 мг вещества. Вторая стадия (первый перенос в системе с противотоком): верхняя фаза пробирки № 0, содержащая 50 мг вещества, переносится в пробирку № 1 со свежей нижней фазой, а нижняя фаза пробирки № 0 нереноентся в пробирку со свежей верхней фазой. Фазы снова перемешиваются и отстаиваются до разделения. Каждая верхняя и нижняя фазы на этой стадии содержат 25 мг вещества. Стадии 3—9 осуществляются аналогичным образом.

5. БЕЛКИ. II

147

?

• ?

/

\

? ?

2

3

4

5

6

7 8

6 '

Номер пробирки

Рис. 5.11 (продолжение), б—конечное суммарное количество вещества в каж дой пробирке (в верхней и нижней фазах).

тоды. Тем не менее по сравнению с другими каскадными методами этот метод наиболее эффективен для разделения граммовых количеств веществ. Кроме того, в продаже имеются установки, содержащие от 50 до 2000 ячеек, в которых каждый перенос пробы осуществляется автоматически. На рис. 5.12 представлены результаты разделения этим методом смеси органических кислот.

5.6.3. Хроматография

Термин «хроматография» в настоящее время применяется для обозначения любого метода разделения, заключающегося в пропускании смеси растворенных веществ через пористый твердый носитель, независимо от природы сил, способствующих разделению (рис. 5.13). Ввиду того, что используется очень много разнообразных хроматографическнх методов, стоит рассмотреть принципиальную основу каждого метода в отдельности.

5.6.3.1. Адсорбционная хроматография

Разделение смесей цветных пигментов растительного происхождения на различных твердых адсорбентах впервые описано в 1903 г. Обнаружено, что экстракты зеленых листьев содержат два зеленых пигмента (хлорофнллы а н Ь), а также несколько желтых пигментов (каротиноидов). Метод был назван хроматографией [chromo (греч.) — цвет и graphein (греч.) — пишу]. Адсорбци-

10*

148

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Номер пробирки

Рис. 5.12. Противоточное распределение смеси четырех органических кислот. Пики слева направо соответствуют уксусной, пропионовой, масляной и валериановой кислотам. Содержание кислоты в каждой пробирке определялось путем титрования раствором едкого натра. [Craig L. С, Craig D., р. 171, in: Technique of Organic Chemistry, vol. 3, Interscience Publishers, Inc. New York, 1950.]

онная хроматография на таких веществах, как древесный уголь, оксид алюминия, диатомитовые земли и силикагель, широко используется для разделения многих типов веществ. Разделение определяется различиями в адсорбции веществ на поверхности определенных адсорбентов, осуществляемой посредством дипольных взаимодействий, водородных связей, а также гидрофобных взаимодействий.

5.6.3.2. Распределительная хроматография

Этот каскадный метод был разработан в процессе поиска простого метода противоточного распределения. Рассуждение строилось следующим образом: если неподвижную фазу закрепить на твердом инертном носителе в цилиндрической колонке, а подвижную фазу пропускать через колонку в условиях равновесия с неподвижной фазой, смесь растворенных веществ будет разделяться по мере того, как подвижная фаза будет проходить через колонку. Первоначально в качестве твердого носителя использовали силикагель, который насыщали водой, содержащей индикатор метилоранж, а в качестве подвижной фазы— хлороформ, насыщенный водой. Было обнаружено, что, если ?-ацетильные производные аминокислот растворить в небольшом объеме подвижной фазы, нанести на такую колонку, а затем пропускать через нее подвижную фазу, то эти производные движутся с разными скоростями. ?-Ацетильные производные аминокислот — д