личить, либо уменьшить растворимость белка. Увеличение растворимости бел-

6. БЕЛКИ. II

139

Рис. 5.8. Растворимость ?-лакто-глобулина в зависимости от рН среды при четырех различных значениях ионной силы.

0,005 ? NaCl

48 5,0 5,г 5,4 5,6 РН

ков в присутствии солей называют солевым растворением (рис. 5.8). Растворимость является функцией ионной силы раствора, которую, зная молярную концентрацию и заряд присутствующих ионов, легко рассчитать по уравнению

где ? — ионная сила, m — молярность, a ?—-заряд иона. Знак суммирования ? означает, что величины ???2, соответствующие каждому иону, складываются. Ионная сила растворов солей однозарядных ионов равна их молярности, а ионная сила, например, 0,1 ? раствора Na2S04 равна

Растворимость любого вещества зависит от относительного сродства молекул растворенного вещества друг к другу (по типу сродства при образовании кристаллической решетки) и к молекулам растворителя. Любой фактор, снижающий взаимодействие молекул растворяемого вещества, будет способствовать его растворению. При солевом растворении малые ионы нейтральных солей взаимодействуют с ионными группами белковых молекул, снижая тем самым белок-белковое взаимодействие и, следовательно, увеличивая растворимость.

Высокие концентрации нейтральных солей приводят к осаждению белков из водных растворов. Это явление называют высаливанием. Двух- и трехзарядные ионы более эффективны в этом смысле, чем однозарядные (рис. 5.9). Обычно для высаливания используют Na2S04, (NH^SO,}, соли магния и фосфаты. Высаливание

? = Vs (0,2-1* + 0,1 22) = 0,3

140

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

наиболее эффективно, в изоэлектрической точке белка. Влияние ио'нной силы на растворимость карбоксигемоглобина показано на рис. 5.9. Высаливание может происходить не только в случае с белками, но также и с газами, незаряженными молекулами и электролитами. Механизм этого процесса сложен. Ионы соли притягивают поляризованные молекулы воды, уменьшая тем самым количество воды, взаимодействующей с белком, поскольку при высоких концентрациях солей количество ионов соли огромно по сравнению с заряженными группами белков. А так как растворимость белков в воде зависит от образования гидратной оболочки вокруг гидрофильных ионных групп, перемещение молекул воды к другим ионам снижает растворимость белка. Влияние солей на растворимость белков и аминокислот в качественном отношении аналогично.

Белки осаждаются также из водных растворов неполярнымн растворителями, смешивающимися с водой. С этой целью обычно используют метанол, этанол и ацетон. На растворимость белков в этих растворителях существенно влияют нейтральные соли. Наиболее удовлетворительных результатов достигают тогда, когда все операции проводят при низких температурах, т. е. в условиях, при которых белки наиболее стабильны.

5.5. Очистка белков

Многие методы очистки белков принципиально подобны методам, применяемым для очистки других веществ, представляющих биологический интерес. Однако одно из основных требований,

1.2

~ 0.8

?

5 0,4

J5> 0

-0,4 - 0,8

-1,21-• 1.6 ¦2,0

- NaCl

кс1 ¦

-

— Na^SOiS. ?.

- 1 ? ? ? ?

2 3 Ионная сила

Рис. 5.9. Растворимость карбоксигемоглобина лошади в солевых растворах различной ионной силы. Имеет место как солевое растворение, так и высаливание. [Cohn ?. J., Edsall J. Т., Proteins, Amino Acids, and Peptides as Ions and Dipolar Ions, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1942.1

Б. БЕЛКИ. II

141

предъявляемых к такого рода методам, заключается в необходимости переведения изучаемого белка в раствор. Даже если известна детальная структура белка, точно предсказать его растворимость невозможно. Вот почему подбор условий очистки белков производится во многом эмпирически, а растворение, являющееся первой стадией очистки, может быть достигнуто только путем опробыва-ния известных методик. Обычно при этом поддерживают температуру около 4°С и стараются избегать экстремальных ?Н, хотя известны и исключения. Многие белки, присутствующие в различных клеточных структурах, могут образовывать ассоциаты с другими веществами, например с липидами, превращающими эти белки в нерастворимые в воде. Исходную ткань измельчают, добиваясь разрушения клеток и обеспечивая тем самым наиболее полное проникновение в них растворителя. Белки часто экстрагируются водой или растворами солей с небольшой ионной силой. Они также могут быть солюбилизированы с помощью слабых растворов детергентов, а также с помощью неполярных растворителей, например ацетона или эфира, удаляющих липиды, или бутанола, разрушающего клеточные структуры.

Для дальнейшего разделения растворенных белков часто используют различия в их растворимости. Большие количества балластных белков или выделяемый белок можно осадить из раствора путем изменения условий, влияющих на растворимость, а именно концентрации солей, рН или концентрации органического растворителя. Часто оказывается эффективным ступенчатое увеличение концентрации (NH4)2S04. Глобулярные белки растворимы в 1 ? (25% концентрации насыщенного раствора) (NH4)2S04 и осаждаются при увеличении концентрации этого раствора до 5,3 моль/л (насыщенный раствор). Можно подобрать такую концентрацию соли (например, 40% концентрации насыщенного раствора), при которой выделяемый белок еще находится в растворе, в то время как другие белки, нерастворимые в этих условиях, осаждаются и могут быть отделены центрифугированием. Затем концентрацию соли увеличивают (например, до 60% концентрации насыщенного раствора) с тем, чтобы нужный белок выпал в осадок, а другие белки остались в растворе. Далее выделяемый белок может быть подвергнут очистке другими методами (описанными в последующих разделах), применяемыми для выделения многих других веществ биологического происхождения.

S.6. Методы разделения и очистки биологически активных веществ

Традиционные методы органической химии, такие, как перегонка, кристаллизация и возгонка, неприменимы для очистки большинства компонентов живой материи, и поэтому для них были раз-

142

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

работаны специальные методы. Проблемы, с которыми приходится сталкиваться при выделении чистых биохимических компонентов, будут рассмотрены ниже. Вещество, подлежащее очистке, должно быть отделено от других компонентов смеси, которая обычно содержит несколько тысяч различных видов молекул, имеющих молекулярную массу от 102 до 108 и присутствующих в концентрациях от Ю-15 до 10~2 моль/л. Выделяемые вещества зачастую неустойчивы; поэтому их не следует подвергать воздействию рН, температуры или давления в их экстремальных значениях. За исключением ряда липидов и некоторых других веществ, большинство веществ биологического происхождения плохо растворяется в органических растворителях, и, следовательно, их очистка должна производиться в водных растворах. Кроме того, в каждом классе биомолекул имеется много подобных друг другу соединений, отличающихся очень незначительно. Например, глицин является одной из 20 аминокислот, обнаруженных в белковых гидролизатах, и его основные свойства подобны свойствам других ?-аминокислот. Поэтому были разработаны селективные методы высокого разрешения, применимые для разделения микроколичеств веществ. Эти же методы во многих случаях используются в весьма чувствительных и количественных аналитических тестах, а также для установления чистоты вешества.

5.6.1. Принципы и классификация методов очистки

Методы, разработанные для разделения биологически активных веществ, во многих отношениях очень сходны между собой и могут рассматриваться как составляющие единого каскада. Характерным свойством каскадного процесса является прохождение смеси веществ через ряд последовательных стадий очистки. Проведя одну стадию очистки, можно добиться лишь частичного разделения составных частей смеси; по мере того как смесь подвергается дальнейшему разделению с использованием сотен, а иногда и тысяч различных стадий, отдельные ее компоненты выделяются и тем самым достигается высокая степень их очистки. Изменения, происходящие от стадии к стадии при разделении смеси с помощью каскадного метода очистки, схематически показаны на рис. 5.10. Можно предположить, что молекулы разделяемых веществ в смеси движутся по каналу, диаметр которого мал по сравнению с его длиной; пространство в канале, не занятое этими молекулами, заполнено растворителем. Молекулы веществ в смеси подвергаются действию силы F], вызывающей их движение по каналу и действующей одинаково на каждую молекулу; однако другая сила F2 действует в противоположном направлении и задерживает молекулы. Если силы торможения для разных молекул в смеси различны, то при прохождении по достаточно длинному каналу начинается их

Б. БЕЛКИ. II

НЗ

а

Время-О

Бремя=т

ш

???-*V Время =2х

Рис. 5.10. Принцип каскадного метода разделения смеси веществ. Раствор двух веществ ? (темные кружочки) и В (светлые кружочки) помещен в специальный канал, площадь сечения которого мала по сравнению с его длиной. Если смесь движется вдоль канала под влиянием постоянной силы Fi, действующей па А и В одинаково, то скорости движения компонентов равны и разделения, как такового, ие происходит (а). Если же задерживающая сила F2 неодинаково действует на А и В, то при движении вдоль канала вещество А отделяется от В (б). Скорость движения компонентов А и В зависит от AFA=F^—F* и AFB=Ff—Ff соответственно, поэтому достигаемое разделение определяется соотношением AfA/AFB. Поскольку вещества А и В находятся под действием постоянных сил, то их разделение будет все более полным по мере прохождения вдоль канала, и наконец, по истечении времени 2х достигается полное их разделение (в). Произвольно малую длину канала можно рассматривать как одну стадию процесса разделения, а весь канал — как серию стадий. Таким образом, вещества А и В подвергаются каскадному методу разделения.

144

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

разделение. Продолжая этот процесс, можно добиться полного разделения компонентов смеси. Как