стными молекулярными массами.

На рис. 5.5 приведен график зависимости объемов элюирования Ve различных белков от их молекулярной массы (молекулярные массы — в логарифмической шкале). Значения молекулярных масс большинства белков хорошо укладываются на приведенной на рисунке пологой кривой. Исключение составляют лишь некоторые белки с ярко выраженной асимметричной формой молекул, например фибриноген и овомукоид.

Таким же методом (рис. 5.5), но с использованием в качестве злюента 6 ? гуанидингидрохлорида, можно довольно быстро определять молекулярные массы субъединиц белков. В этом растворе молекулы белков полностью теряют свою конформацию (гл. 6), и, таким образом, форма молекул не влияет на правильность определения молекулярной массы, как это имеет место в случае гель-фильтрации нативных белков. Отметим, что, прежде чем приступать к анализу белка данным методом, следует восстановить ди-сульфидные связи.

5.1.7. Гель-электрофорез и гель-фильтрация в присутствии додецилсульфата натрия

Белки под действием детергента додецилсульфата натрия (ДСН) денатурируют и диссоциируют на субъединицы. Инкубация белка в растворе ДСН при 100°С в течение нескольких минут приводит к разворачиванию белковых молекул и связыванию с ними молекул ДСН (примерно одна молекула ДСН на каждые два аминокислотных остатка). Образовавшиеся комплексы содержат —? ,4 г ДСН на 1 г белка. Алифатические додецильные группы

250

230

210

190 -

no

>ы 160

130

110

90

70

-сахароза

химоглрипсиноге!

яичный альбумин

опомукоид

бычий сывороточный альбумин

трансферрин-¦

лактопероксидаза

фетуин-czj

димер сывороточного альбумина аякогольдегидрогенаэа дрожжей

церулоплазмин ?- глобулины

R-фикоэритрин

оС-конарахин

фибриноген

малаглдегидрогеназа

фосфатаза ? сок

-глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназа

лаитат дегидрогеназа альдолаза

фумараза каталаза

¦апоферритин

J-1 I ? ? ? ? I

I ? ? ? ? ? 1

уреаза-оС-крипталлин-

J_

-р-галаитозидаза _ -ферритин

голубой декстран

? ? ? ? ?

3,0

2,5

— 2,0

1,5

1,0

??"

??5

Молекулярная масса

10"

Рис. 5.5. Зависимость объема элюирования Ve от молекулярной массы белка при фракционировании на колонке со сшитым декстраном (сефадекс G-200; колонка 2,5X50 см) при рН 7,5. Светлые прямоугольники соответствуют глнкопротеинам. Va —

свободный объем колонки. [Andrews P., Biochem. J., 96, 595, 1965.]

5. БЕЛКИ. II

135

миозин (200000)

фоароршгазг А (100000)

бычий сывороточный альбумин (68000)

[ яичный альбумин ,i (43000)

?. глицеральдегид-З-фОС-I фат-дегидрогенага {36 ООО)

карбоангидраав (29000)

миоглобин (П200) цитохром сППОО)

0,4 С.6 Подвижность

Рис. 5.6. Разделение смеси белков электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. а — электрофорез смеси белков в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содержащем 0,2% ДСН; белки двигались сверху вниз; после электрофореза для обнаружения белковых зон гель окрашен красителем бриллиантовым голубым Кумасси. Название белка и его молекулярная масса указаны около соответствующей зоны, б — подвижности 24 белков (относительно подвижности красителя, принятой за 1) при ДСН-электрофорезе в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы (от 11 700 до 68 000): наибольшей подвижностью обладает цитохром с, а наименьшей — сывороточный альбумин. \Weber К., Osborn ?., p. 180, in Neurath ?., Hill R. L., eds., The Proteins, vol. II, Academic Press, Inc., New York, 1975.]

располагаются внутри комплекса, тогда как сульфокислотные — на поверхности. Суммарный отрицательный заряд такого комплекса намного превышает заряд боковых цепей аминокислотных остатков белка. Комплексы ДСН — белок имеют палочкообразную форму с диаметром ~1,8 нм и длиной пропорциональной молекулярной массе полипептидной цепи. И такие комплексы обладают примерно одинаковым отрицательным зарядом, приходящимся на единицу массы, и, следовательно, при зональном электрофорезе (разд. 5.6.4) в гелях с однородной пористостью мигрируют со скоростью, обратно пропорциональной молекулярной массе. На

146

t. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

рис. 5.6 приведен типичный образец геля, на котором с помощью электрофореза было проведено разделение смеси белков, а также дана логарифмическая зависимость подвижности от молекулярной массы. Если в белках имеются дисульфидные связи, то их следует предварительно восстановить. Некоторые белки, например белки с высоким содержанием углеводов, при анализе данным методом ведут себя аномально. Метод имеет также широкое применение для оценки сложных смесей мембранных белков и определения их молекулярной массы, поскольку мембранные белки, например белки мембран эритроцитов, плохо растворимы (гл. 32).

Кроме того, молекулярные массы белков можно определять с помощью гель-фильтрации, подобно тому как описано выше (рис. .5.5), но используя в качестве растворителя водный раствор ДСН.

5.2. Форма белковых молекул

Зная константу седиментации и коэффициент диффузии D, можно рассчитать величину относительного трения

f/fo= 1(Н[(1-^)/(?)»#»

где все обозначения совпадают с введенными выше (разд. 5.1.1). Величина /о представляет собой молярный коэффициент трения компактной сферической и негидратированной частицы. При ///о = = 1,0 форма молекулы близка к негидратированной сфере. При /У/с>1.0 молекулы могут быть гидратированы или асимметричны или одновременно и гидратированы, и асимметричны. Молекулы многих глобулярных белков, по-видимому, имеют сферическую или близкую к сферической форму. К таким белкам относятся рибону-клеаза, инсулин, химотрипсиноген, пепсин. Однако молекулы многих других белков явно асимметричны и существуют в растворе в виде вытянутых эллипсоидов или палочек. Белок плазмы крови — фибриноген, являющийся предшественником фибрина при образовании тромба, а также миозин, основной белок мышечных волокон, представляют собой вытянутые эллипсоиды. Установлено, что молекула фибриногена человека имеет в поперечнике 3,8 нм, а ее длина составляет 70 нм. Растворы таких молекул проявляют ярко выраженную способность к рассеянию света, и поэтому форма молекул, а также их молекулярная масса могут быть определены с помощью измерения рассеяния света.

Вязкость раствора при данной концентрации растворенного вещества зависит от молекулярной массы и формы молекул этого вещества. Белки, молекулы которых резко асимметричны, обладают большей характеристической вязкостью, чем белки с такой же молекулярной массой, но со сферической формой молекул. Если

5. БЕЛКИ. II

137

известна молекулярная масса, то по изменению вязкости в зависимости от концентрации растворенного вещества можно оценить форму молекул.

5.3. Амфотерные свойства

Белки, как и аминокислоты, являются амфолитами и мигрируют в электрическом поле со скоростью, зависящей от их суммарного заряда и рН среды. При определенном для каждого белка значении рН его молекулы оказываются электронейтральными. Это значение рН называют изоэлектрической точкой и обозначают р/; некоторые типичные величины р/ приведены в табл. 5.1. Изоэлектрическая точка белка зависит от числа и природы заряженных групп в молекуле. Белковая молекула заряжена положительно, если рН среды ниже р/, и отрицательно, если рН среды выше р/.

Число ионизованных групп в белке можно определить с помощью титрования от изоэлектрической точки кислотой или основанием; кривая титрования гемоглобина лошади (рис. 5.7) типична для глобулярных белков. В табл. 5.2 приведены характерные значения рК ионизованных R-групп белков. Точное значение рК. отдельной ионизованной группы данного белка может несколько отличаться от значения, указанного в табл. 5.2 и зависящего от электростатического окружения этой группы. Например, каждая из ?-карбоксильных групп белка может иметь несколько отличное от других значение рК, но вместе эти группы дают при титровании кажущееся значение р/С, приблизительно равное 4,4. Влияние локального окружения проявляется в экстремальных значениях р/С

160

Рис. 5.7. Кривая титрования кристаллического гемоглобина лошади. [Cohn ?. Green ?. ?., ????-chard ?. ?., J. Am. Chem. Soc, 59, 590, 1937.]

¦138

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Таблица 5.2

Характерные значения рК кислотных и основных групп белков

Группа vKa npt 25 °С Экстремальные значения рА'

?-Карбокснльная (концевая) 3,0—3,2 1—6,8

?-Карбоксильная (аспарагнновая кислота) 3,0—4,7 1—6,8

*у-Карбоксильная (глутаминОвая кислота) ~4,4 1—6,8

Имидазольная (гистидин) 5,6—7,0 5,6—7,5

?-Аминогруппа (концевая) 7,6—8,4 7,3—>] 2

?-Аминогруппа (лизин) 9,4—10.6 7,3—>12

Туанидиновая (аргинин) 11,6—12,6 11,5—12,6

Фенольный гидроксил (тирозин) 9,8—10,4 9,4—>12

Сульфгндрильная (цистеин) ~8—9 8—9,5

некоторых ионизованных R-групп, которые также приведены в табл. 5.2.

Как амфолиты, белки связывают и катионы, и анионы. Специфическое связывание белками небольших ионов, например иона Са2+, играет важную роль в физиологических процессах. Некоторые органические и неорганические вещества легко осаждают белки нз растворов. К таким веществам относятся трихлоруксусная, пикриновая, фосфовольфрамовая кислоты, а также ионы тяжелых -металлов, такие, как Hg2+ и Ва2+. Многие нативные белки являются металлопротеинами (конъюгированными белками); они специфически связаны с ионами Cu2+, Zn2+, Fe2+ и Fe3+ в координационные комплексы с участием различных ионизованных групп.

5.4. Растворимость

Каждый белок обладает определенной растворимостью, зависящей от природы самого белка и состава растворителя. На растворимость существенное влияние оказывает рН среды. Обычно растворимость минимальна в изоэлектрической точке (рис. 5.8). Вероятно, это происходит вследствие того, что в изоэлектрической точке силы электростатического отталкивания минимальны, а силы, способствующие формированию кристаллической решетки, максимальны. При отклонении рН в любую сторону от р/ белки приобретают положительный или отрицательный заряд, а их растворимость увеличивается.

Присутствие солей в растворе может либо уве