Биологический каталог




Основы биохимии. Том 1

Автор А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, Р.Хилл, И.Леман

на рис. 5.3 приведены кривые седиментации, полученные с помощью шлн-рен-оптнкн. Ультрацентрифугирование является полезным при изучении стабильности белков, так как в различных условиях, например при экстремальных значениях рН или температуры, может происходить агрегация или диссоциация, что легко обнаруживается по изменению коэффициента седиментации. В табл. 5.1 приведены молекулярные массы некоторых белков, полученные с помощью седнментационного анализа. Современные методы позволяют определять молекулярные массы с погрешностью, не превышающей 5%.

5.1.2. Метод седнментационного равновесия

На практике коэффициенты седиментации можно определить достаточно точно. Определение же коэффициентов диффузии гораздо более трудоемко. Поэтому метод седиментационного равновесия, который не требует определения коэффициента диффузии, намного удобнее и более широко используется для установления молекулярных масс белков. В этом методе ультрацентрифугирование продолжают до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное распределение изучаемого белка по всей длине ячейки. При равновесии не происходит видимого перемещения белка в ячейке, поскольку его движение ко дну ячейки под действием центробежной силы полностью уравновешивается движением вверх, обусловленным диффузией. Такое равновесное распределение характерно для каждого белка и зависит от его молекулярной массы. После дости-

9—1148

130

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

жения равновесия можно измерить концентрацию белка по всей длине ячейки, используя оптическую систему, описанную выше для определения скорости седиментации. Уравнение для расчета молекулярной массы по методу седиментационного равновесия имеет следующий вид:

2RT In с

м =----—

co3xs (1 — up)

где R, ?, ?2, и и ? уже определены выше, а с — концентрация белка на расстоянии ? от оси вращения в ячейке ультрацентрифуги. Преобразуя это уравнение, получаем

In с = ? (1 - up) График зависимости In с от ?2 — прямая, наклон которой равен ??(1—vp)w2/2RT. Поскольку с, ?,~?, ?, ?2, R и ? легко измерить или рассчитать, ? можно определить по наклону построенной прямой. Кроме того, молекулярная масса может быть рассчитана непосредственно для любой концентрации и соответствующего значения х, и если рассчитанное значение сохраняется постоянным в любой точке графика зависимости In с от х2, то можно считать исследуемый белок гомогенным. В противном случае (белок гетерогенен) зависимость In с от х2 не линейна. Преимуществом описанного метода является также то, что для анализа можно использовать очень небольшие концентрации белка.

5.1.3. Седиментация в градиенте сахарозы

Принципиально возможно определение коэффициентов седиментации и, следовательно, приблизительных молекулярных масс даже не вполне индивидуальных белков, если имеется подходящий метод для измерения относительных концентраций белков, например путем измерения их ферментативной активности. Изучаемый образец осторожно наносится на раствор сахарозы с линейным градиентом концентрации и подвергается высокоскоростному центрифугированию в роторе с откидывающимися пробирками (в ба-кет-роторе). Обычно в качестве стандарта в раствор добавляется белок с известным коэффициентом седиментации s. Вещества с различными седиментационными свойствами отделяются в градиенте плотности друг от друга, образуя полосы. По окончании центрифугирования в нижней части центрифужной пробирки проделывают небольшое отверстие, фракции сливают и анализируют. Если фракции отбирают через различные промежутки времени центрифугирования, то временная зависимость расстояния от мениска до зоны белка, обладающего активностью, должна быть линейной. Для данного времени центрифугирования соблюдается следующая

5. БЕЛКИ. II

131

Рис. 5.4. Схема простого осмометра. Осмотическое давление определяется разностью между высотой столба буферного раствора (дс) и высотой столба раствора белка (ft) в капилляре.

раствор белка

буферным раствор

приблизительная закономерность, справедливая для веществ с почти сферической формой частиц и близкими значениями ? (в качестве стандарта используется белок с известным коэффициентом седиментации s):

расстояние от мениска до зоны неизвестного белка расстояние от мениска до зоны белка-стандарта j

%>,[?) неизвестного белка / ? неизвестного белка \2/3 %>,[?) белка-стандарта \ ? белка-стандарта ]

5.1.4. Осмотическое давление

Полупроницаемые мембраны, изготовленные из таких материалов, как коллодий или целлофан, имеют поры, пропускающие молекулы воды и другие небольшие молекулы, но не пропускающие макромолекулы. Таким образом, если белок в буферном растворе поместить в мешочек из полупроницаемой пленки, а последний в свою очередь опустить в буферный раствор (рис. 5.4), то молекулы воды и буфера (ио не молекулы белка) будут свободно проходить через мембрану как внутрь мешочка, так и из него. Вследствие наличия молекул белка концентрация (или, точнее, термодинамическая активность) молекул воды различна по разные стороны мембраны и перемещение молекул воды внутрь мешочка идет лучше, чем в обратном направлении. Этот процесс будет продолжаться до тех пор, пока эффективные концентрации воды по обе стороны мембраны не выравняются. В приборе, показанном на рис. 5.4, жидкость поднимается по капилляру, соединенному с диализным мешочком. Осмотическое давление, т. е. сила, заставляющая жидкость подниматься вверх по трубочке, измеряется такой высотой столбика жидкости в капилляре, которая достаточна для компенсации стремления раствора белка вытолкнуть присутствующие соли

9*

132

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

через мембрану и поднять столбик жидкости выше. Осмотическое давление — свойство раствора в целом, оно является функцией общего числа растворенных частиц (иоиов или молекул) в единице объема, ио не зависит от их природы. Это свойство присуще раствору независимо от того, ограничен ои полупроницаемой мембраной или нет. Измеряемое экспериментально осмотическое давление в каждом частном случае зависит от свойств используемой мембраны. Осмотическое давление связано с молекулярной массой частиц следующим уравнением (которое аналогично уравнению состояния идеального газа):

nV = -frRT

где ? — осмотическое давление в атмосферах (1 атм=760 мм ртутного столба), V — объем раствора белка в литрах, g— масса белка в граммах, ? — молекулярная масса, R—-газовая постоянная (0,082 л-атм-град_1-моль-1) и ? — температура в кельвииах. Приведенное выше уравнение справедливо только в случае бесконечного разбавления, поэтому измерение проводится при нескольких концентрациях белка и ? получают экстраполяцией к бесконечному разбавлению. Из уравнения следует, что чем больше молекулярная масса белка, тем ниже осмотическое давление (в пересчете иа 1 г вещества). Однако в действительности метод не применим к белкам с молекулярной массой, превышающей несколько сотен тысяч.

На осмотическое давление сильное влияние оказывают заряд белка и концентрация электролитов буфера. Вследствие того, что молекула белка заряжена, а по обе стороны мембраны должна поддерживаться электроиейтральность, концентрации диффундирующих ионов по разные стороны мембраны могут различаться, что будет влиять на осмотическое давление. Однако этими эффектами можно пренебречь, если осмотическое давление измерять в изоэлектрической точке белка или же при значениях рН, отличающихся от изоэлектрической точки, но при высоких концентрациях электролитов. В настоящее время измерение осмотического давления с целью определения молекулярной массы используется редко. Экспериментально наблюдаемое осмотическое давление отражает среднюю молекулярную массу всех белков, присутствующих в рагтворе. Таким образом, только для чистых белков можно ожидать получения истинных значений молекулярной массы. В противоположность другим методам, имеющимся сейчас в распоряжении, этот метод совершенно не дает представления о гомогенности исследуемого препарата белка.

5.1.5. Определение молекулярной массы белков на основании их состава

Минимальная молекулярная масса Mmin любого соединения может быть рассчитана из его элементного состава. Этот прием не применим для белков, состоящих из множества атомов С, ?, N и О. Однако минимальные молекулярные массы некоторых белков, содержащих небольшое число атомов какого-либо элемента, могут быть установлены точно. Например, гемоглобин содержит 0,34% железа (атомная масса железа 55,8). Минимальная молекулярная масса, рассчитанная по формуле

атомная массах 100 min содержание элемента в масс. %

равна 16 700. Для гемоглобинов такие значения были получены почти 100 лет назад; они послужили первым указанием на то, что молекулы белков крупнее, чем молекулы других органических соединений, известных в то время. Определенная позже действительная молекулярная масса гемоглобина оказалась равной — 65 000, т. е. молекула гемоглобина содержит четыре атома железа.

5. БЕЛКИ. II

13.3

Mmin может быть рассчитана подобным же образом, исходя из содержания остатков аминокислот, присутствующих в белке в небольших количествах. Например, бычий сывороточный альбумин содержит 0,58·% триптофана (молекулярная масса триптофана 204,23). Отсюда Mmin для этого белка равна 35 200, что составляет около половины действительной молекулярной массы, равной 69 ООО. Часто, однако, молекулы белков вообще не содержат таких редких атомов или аминокислотных остатков, которые можно было бы использовать для определения молекулярной массы. В этом случае целесообразно применение физических методов.

5.1.6. Фильтрация на молекулярных ситах

Определение молекулярных масс белков возможно также с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии на полисахаридных или полиакриламидных гелях с поперечными сшивками (разд. 5.6.3.4). Этот метод, названный гель-фильтрацией, позволяет производить оценку гомогенности по размерам молекул, а также разделять белки с различными молекулярными массами. Зная объем элюирования изучаемого белка, можно оценить его величину, если колонка предварительно прокалибрована по белкам с изве

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106

Скачать книгу "Основы биохимии. Том 1" (7.28Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.11.2019)