ют в реакции, в которых принимают участие функциональные группы их боковых цепей. Например, цистеин вступает в реакции, характерные для сульфгидрильной группы (—SH), тирозин — в реакции феноль-ной группы и т. д. Такие же реакции характерны для белков, содержащих соответствующие R-группы.

4.2.5.1. Реакция с нингидрином

Аминокислоты взаимодействуют с нингидрином (гидратом трикетогидрин-дена) с образованием С02, аммиака и альдегида, содержащего на один атом углерода меньше, чем соответствующая аминокислота. В результате реакции возникает голубое или фиолетовое окрашивание, что позволяет осуществить колориметрическое количественное определение аминокислот. Однако эта цветная реакция ие является специфической для аминокислот, поскольку окрашенный продукт с нингидрином дает и ??3, и многие другие соединения, содержащие аминогруппу (в том числе пептиды и белки), с тем лишь отличием, что при этом ие выделяется С02. Поэтому образование С02 при реакции с нингидрином —¦ характерный признак присутствия свободной карбоксильной группы, расположенной рядом с аминогруппой, т. е. специфично для а-аминокарбоно-вых кислот. Пролин и оксипролии при реакции с нингидрином образуют производное, окрашенное в желтый цвет.

Реакция нингидрина с ?-аминокислотой протекает следующим образом:

Л—С—СООН + ?

?

??-аминокислогла «ингидрин [трикетогиндринденгилрат)

4. БЕЛКИ. I

119

+ С02 + R—С=0

?

ОН

дииетогидриндилидендикетпогидрин-дамип

альдегид

4.2.5.2. Специфические реакции аминокислот

Цветные реакции отдельных аминокислот широко используются для аналитических целей. В такие реакции вступает также большинство белков, что помогает при их количественном определении нли идентификации. Некоторые из перечисленных ниже реагентов используются для опрыскивания бумажных хро-матограмм с целью обнаружения отдельных аминокислот или пептидов, содержащих эти аминокислоты (разд. 5.6.3.2).

Реакция Сакагучи. Гуаничины при взаимодействии с ?-нафтолом и гнпохло-рндом натрия в щелочной среде дают красное окрашивание; эта реакция применяется для обнаружения аргинина.

Реакция с альдегидами. Производные индола при взаимодействии со многими ароматическими альдегидами образуют интенсивно окрашенные продукты. л-Диметиламннобензальдегнд в H2SO4 при реакции с триптофаном дает красно-фиолетовое окрашивание (реакция Эрлиха). Эта реакция может быть использована для количественного определения триптофана в белках.

Реакция Паули на гистидин и тирозин. Гистидии и тирозин в щелочных растворах реагируют с диазотированной сульфаннловой кислотой, образуя производные, окрашенные в красный цвет.

Биуретовая реакция. ?-Амннокнслоты в пептидах дают бнуретовую реакцию, которая используется для качественного и количественного определения белка в растворе с помощью спектрофотометрнческнх методов. Бнурет образуется при нагревании мочевины до ~180°С.

В присутствии сильной щелочи биурет дает с раствором CUSO4 фиолетовое окрашивание. В бнуретовую реакцию вступают пептиды, содержащие по крайней мере две пептидные связи, т. е. трнпептиды и т. д. Дипептнды и аминокислоты (кроме гистнднна, серина и треонина) не вступают в эту реакцию.

Реагент Эллмана. Существует много методов обнаружения тиоловых групп цистеина в пептидах и белках. Один из них — реакция с 5,5'-днтнобнс(2-ннт-робензойной кислотой), в результате которой происходит образование тионнтро-бензойной кислоты, обладающей в слабощелочной среде (рН 8) сильным погло-

О

II

2?2?—С—??2

мочевина

нагревание

120

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

щеннем при 412 нм. Поэтому количество образующегося в результате реакции продукта может быть опретелено спектрофотометричсскн.

N02 N02

NH2

+ HS-CH2—CH—COOH

5,5-дигпиобис (2-нитрооенэойная кислота)

NO,

СООН

NO,

СООН

NH,

I

—S-CH2-CH-COOH SH

тионитпробензойи-т кислота

4.2.6. Номенклатура

Согласно номенклатуре пептидов, аминокислотные остатки перечисляются в порядке их расположения в цепи, начиная со свободной «-аминогруппы, которую при изображении структуры пептида обычно располагают слева. Название каждого остатка получаст окончание -ил, за исключением концево.о остатка, несущего незамещенную карбоксильную группу. Тетрапептид алапилглицилтиро-зилглутамнповая кислота имеет следующую структуру:

NH, О

СН,—СН—С—NH—СН,

-NH—СН-С—NH—СН—СООН

I I

сн,

сн, I 2

СООН

ОН

аланилглицилтпирозилглутаминовая кислота

Названия аминокислотных остатков образуются, как уже было упомянуто, путем добавления окончания -ил. Таким образом, названия глнцил, аланнл, серил н т. д. используются соответственно для остатков глицина, аланина, серина. Не следует путать глутамнл и глутаминил, а также аспартил и аспара-гиннл. При написании последовательностей длинных пептидов вместо полного названия удобно использовать трех- или однобуквенные обозначения. В табл. 4.1

4. БЕЛКИ. I

121

приведены общепринятые обозначения, используя которые вышеупомянутый тетрапептид можно записать следующим образом:

H.2N—Ala—Gly—Туг—Glu—СООН или ?GYE

Такие сокращения применяются только для обозначения остатков в последовательности, но не для свободных аминокислот.

4.2.7. Синтез пептидов

Органический синтез сложных пептидов сопряжен с определенными методическими трудностями. Прежде всего для того, чтобы соединить аминокислоты специфической пептидной связью, следует «защитить» те их амино- и карбоксильные группы, которые не должны участвовать в ее образовании, и таким образом снизить их реакционную способность. Кроме того, нужно блокировать все реакционноспособные боковые цепи аминокислот или проводить реакцию с образованием связи между аминокислотами таким способом, при котором эти группы не затрагиваются. Некоторые из защитных групп, используемых в пептидном синтезе, приведены в табл. 4.3. Далее конденсация должна проводиться таким образом, чтобы не происходило рацемизации или химического изменения боковых цепей. Большинство реакций образования пептидной связи включают активацию ?-карбоксильных групп, обычно путем получения определенных типов смешанных ангидридов кислот или реакционноспособных сложных эфиров;

Таблица 4.3

Некоторые защитные группы, используемые в пептидном синтезе

Защитная группа

Блокируемая группа

Метод удаления защитной группы

Карбобензоксигруппа (Cbz)

Трифенилметильная (три-тильная)

трег-Бутоксикарбонильная 'Фтал ильная Трифторацетильиая Бензильная

?-Толуолсульфонильиая (тозильиая)

Этокси- или метоксиэфир-ная

Бензоксиэфирная грег-Бутоксиэфирная

Ацетильная

Аминогруппа

Сульфгидрильная Аминогруппа Карбоксильная »

Гидроксидная

Н2/палладиевая чернь; в уксусной кислоте

H2/Pd

НВг

Трифторуксусная кислота

Гидразин

Слабая щелочь

Металлический натрий в жидком аммиаке

То же

Слабая щелочь

Слабая щелочь; H2/Pd

Трифторуксусная кислота; НВг в уксусной кислоте

Слабая щелочь

122

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Таблица 4.4

Некоторые конденсирующие реагенты, применяемые в пептидном синтезе

Конденсирующий реагент

Структура

Смешанный ангидрид

Дициклогексилкар-бодиимид (ДЦКД)

Изобутилхлорфор-миат

?,?'-Карбонилдиими-дазол

п-Нитрофениловый эфир3

/ \_N—Г—N1—/ \

о

il

с4Н9-0—с—С1

? о n

II /=

;n-c—n.

о ??—

r—с—о—с

11 /—Ч

о о il II r-c-0—с—о—qh,

II

r—с—n

о

r—с—о—

. //-no,

Получают при взаимодействии аминокислоты и л-иитрофенола в присутствии ДЦКД.

некоторые из них приведены в табл. 4.4. И наконец, защитные группы должны удаляться количественно в мягких условиях, в которых не происходит перегруппировок, рацемизации или разрывов образованных пептидных связей.

Если группы, блокирующие NH2— и —соон, обозначить соответственно ? и Z, а соединение, образующее смешанный ангидрид, — X, то синтез дипептида можно представить в виде следующей серии реакций:

НЯ-СНк'-СООН

YHN—CHR1—СООН HjN—CHR2 —СООН YHN—CHR1 —СОХ + H2N—CHR2—COOZ

J

YHN—CHR1 — CO—NH—CHR2—COOZ

снятие эящит-у/ N. снятие только

ных групп yf защитной ? и ? у/ Х^группы ?

H2N—CHR1 — CO—NH—CHR2—COOH H2N—CHR1 — CO—NH—CHR2 —COOZ

4. БЕЛКИ. I

123

Существует много способов синтеза более длинных пептидов. Например, можно провести конденсацию пептида (у которого защитная группа ? снята, a ? блокирует СООН) с YiNH—CHR3—СОХ. Другим способом синтеза может служить реакция активированного пептида с ?-защищеиной аминогруппой и пептида с ?-защищенной карбоксильной группой. Приведенный ниже синтез глициллейци-на иллюстрирует одни из возможных путей, который может быть использован для получения дипептида:

II

СН2—О—С—С1 + ?2?—сн2—СООН Cbi-Cl глицин

сн3ч ™* сн—сн,—с—с

?

ООН

сн,

СН

\

I

у

лейцин

|с^,он.н-

??,

I

СН—СН,—С—СООСоН,

сн,

?

этиловым эфир лейцина

ООН

Cbz-глицин +

О

с4н„—о—с—?

изобутилхлоркарбонат

о о о

II II II

СН2—О—С—NH—СН2—С—О—С—С4На

смешанный ангидрид (промежуточное соединение)

СН.

¦сн"

сн,

О О СН2 О

If II I II СНР—О—С—NH—СН2—C-NH—С-С-ОС2Н5 + с.н,—о-

н

. * этиловый эфир Cbz-глициллейцина

с 'эдкр 1. обработка ? стадия 2: газиоораз-рч.зсээле^гГ! щелочью для 1 ный нй,РЬ для уц?г?чио эфирной группы I удаления Cbz

О II

-с—он

СН3ч /СН

с

3

сн

I

сн, о

ЭЧ2—С—NH—СН—С—ОН ?

глициллейчин толуол

/Г~ СН3 + С02 + СН3СН2ОН

Синтез пептида может быть осуществлен не только в растворе, но и с помощью так называемого твердофазного метода. В соответствии с этим методом аминокислоту присоединяют карбоксильной группой (посредством сложноэфирной связи) к нерастворимому полимеру, а затем проводят реакцию с защищенной аминокислотой, в результате чего образуется пептидная связь. При этом синтезируется защищенный дипепгид, по-прежнему прикрепленный к полимеру. Защитную группу можно удалить, а весь процесс повторять до получения желаемого продукта. Затем пептид отделяют от полимера. Преимущество метода заключается в том, что на каждой стадии примеси и побочные продукты легко удаляются простым промыванием полимерного носителя подходящими растворителями. Кроме того, при использовании в реак