скольку их вклад в общее количество воды в растворе ничтожно* мал). рН полученного раствора можно снова рассчитать с учетом увеличения концентрации соли и уменьшения концентрации кислоты:

0,11

рН = 5 + ig-67oT

Значение рН увеличилось всего на 0,09 и стало равно 5,09. Аналогнчкно добавление 0,01 моля сильной кислоты уменьшило бы рН на 0.09, а конечное значение рН стало бы равно 4,91.

Сопоставим такое поведение описанного буферного раствора с поведением: раствора сильной кислоты, например НС1, при том же значении рН 5. Концентрация НС1 при этом рН составляет 0,000 01 моль/л, и добавление 0,01 моль основания изменяет рН раствора почти до 12, т. е. на 7 единиц, что происходит из-за отсутствия «резервных» недиссоциироваиных молекул кислоты. Даже при* рН 2 (0.01 моль/л НС1) добавление 0,01 моля основания повышает рН до нейтрального, т. е. на 5 единиц.

Следует подчеркнуть, что в области рН 2—12, где слабые кислоты и основания проявляют свои буферные свойства, буферная емкость различных систем представляет основу поддержания постоянного рН. В нейтральной области рН, в которой функционирует большинство живых клеток, биологически наиболее важными являются буферные пары угольной и фосфорной кислот.

Уравнения (7) и (???) записаны в такой форме, которая очень удобна для рассмотрения процесса титрования всех слабых электролитов. На рис. 4.5 пока-

8—1148

«14

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

зана кривая титрования одноосновной слабой кислоты. рН в средней точке этой кривой, соответствующей 50% необходимой для титрования кислоты (или основания), и есть значение рК, поскольку в этой точке [соль]/[кислота] = 1, а ig[соль]/[кислота] =0. Буферная емкость максимальна при рН=рК и уменьшается в более кислых или более основных растворах. Таким образом, буферная емкость определяется главным образом отношением концентраций соли и кислоты. Когда это отношение равно единице, рН=р/С и буферная емкость максимальна. На рисунке это соответствует точке перегиба кривой титрования, а рН в точке перегиба дает рК. Следует подчеркнуть еще раз, что растворы слабой кислоты или соли слабой кислоты по отдельности не проявляют свойств ¦полной буферной системы.

В случае многоосновных кислот каждая группа имеет свое характеристическое значение рК, которое можно определить по уравнению (7). В табл. 4.2

Таблица 4.2

Значения рКа некоторых полезных и биологически важных соединений

Соединение Соединение

Фосфорная кислота (???) 2,0 Лимонная кислота (р/С3) 6,4

Лимонная кислота (???) 3,1 Фосфорная кислота (рКг) 6,7

Муравьиная кислота 3,8 Имидазол 7,0

Молочная кислота 3,9 Диэтилбарбнтуровая кислота 8,0

Бензойная кислота • 4,2 7рис(оксиметил) аминометан 8,1

Уксусная кислота 4,7 Борная кислота 9,2

Лимонная кислота (рКг) 4,7 Ион аммония 9,3

Пиримидиний-ион 5,3 Ион этиламмония 9,8

Какодиловая кислота 6,2 Ион трнэтиламмония 10,8

Маленновая кислота 6,2 Угольная кислота (рКг) 10,4

Угольная кислота (???) 6,3 Фосфорная кислота (рКз) 12,4

приведены значения рК ряда соединений, которые либо используются для приготовления буферных растворов, либо интересны как компоненты биологически важных буферных систем.

Индикаторы

Многие слабые электролиты в различных областях рН могут быть либо характерно окрашены, либо бесцветны. Эти вещества используются в качестве индикаторов при определении рН растворов. В общем виде можно представить себе, что индикатор — это кислота Н1п, которая может существовать в двух различно окрашенных формах:

Н1г. (цвет А) <—> In- (цвет Б) + Н4-

4. БЕЛКИ. I

IIS

Из уравнения Хендерсоиа — Хассельбаха следует

[In-]

РН = РК+^1ШпГ

При любом рН отношение [1п]/[Н1п] соответствует отношению значений оптической плотности при двух определенных длинах волн (цвет Б/цвет А). Такую-смесь окрашенных веществ можно визуально сравнивать с цветными стандартами и таким образом проводить быстрое определение рН. Перечень широко применяемых индикаторов и сведения об их свойствах можно найти в химическнх. справочннках.

4.2.4. Аминокислоты как электролиты

?-Аминокислоты существуют в водных растворах преимущественно в виде биполярных ионов. Как было установлено для нескольких ?-моноаминомонокарбоновых кислот, отношение числа биполярных ионов к числу незаряженных молекул в состоянии равновесия между этими формами

NH2 +NH3 R—С—СООН -¦=; R—С—СОО-? и

составляет 105—106. Хотя для удобства ?-аминокислоты часто-изображают в виде незаряженных молекул, все они существуют в-растворах в форме анионов, катионов, электронейтральных биполярных ионов или смеси этих форм, причем доминирование какой-либо из них зависит от рН раствора. Значение рН, при котором биполярный ион не перемещается в электрическом поле, называют изоэлектрической точкой (р/); при таком рН число положительных и отрицательных зарядов в белке одинаково. рН раствора чистой аминокислоты в воде называется изоионной точкой. Изоэлектриче-ские и изоионные точки аминокислоты в разбавленных растворах: приблизительно совпадают.

?-Аминокислоты имеют по крайней мере две (потенциально) кислотные группы: недиссоциированную карбоксильную группу и протонированную аминогруппу. Гидрохлориды аминокислот — сильные электролиты и в воде диссоциируют

C1-NH3-CHR—СОСН -<—CI- -j- +NH3—CHR—СООН

образуя катион (справа). Этот катион содержит две слабокислотные группы с характеристическими значениями р/С; для удобства эти значения р/С обозначены р/С,, р/Сг и т. д. (чем меньше номер,, тем к более сильной кислотной группе относится константа). Таким образом, константа диссоциации p/Ci упомянутой аминокислоты от-

8

116

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

1.8 1.6

1.4 1.2 1.0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

- / рАГг = 9.6

~~ / F /-Р*1 = 2.3 л/ /f . I I I I 7 I I I , ? I

6 6

РН

10

12

Рис. 4.6. Кривая титрования моноаминомонокарбоновой кислоты, например глицина (???=2,3; ? Кг=9,6). В кислом растворе А глицин существует в виде глицин-гидрохлорида; в растворе В — в виде глицината натрия. Изоэлектрическая точка

р/=6 (разд. 4.2.4).

носится к ее карбоксильной группе:

t Н+ + +NH3—CHR—СОО

+NH3—CHR—СОСН

Кг

[Н+] [Rfl IR+1

где R+— катион (слева), a —биполярный ион (справа). Если раствор гидрохлорида аминокислоты титровать, добавляя 2 экв. NaOH, то зависимость изменения рН от количества добавленных эквивалентов ОН- будет иметь вид, представленный на рис. 4.6. После добавления 0,5 экв. основания рН раствора становится равным ??? (рК карбоксильной группы); при этом в растворе присутствуют равные количества R+ и R*. После добавления 1 экв. основания доминирующей формой становится Я± (биполярный ион), а рН раствора — равным р/. Биполярный ион — также слабая кислота благодаря наличию аммонийной группы, диссоциирующей следующим образом:

+H3N—CHR—СОО- zf=±: Н++ H2N—CHR—СОО-

[H+I [R-]

где ^ — биполярный ион (слева), a R~—анион (справа). Добавление 1,5 экв. основания к раствору аминокислоты приводит к титрованию аммонийной группы, в результате чего рН достигает рК2

4. БЕЛКИ. I

117

(р/С аммонийной группы). 2 экв. щелочи полностью оттитровывают аминокислоту. Полученный раствор содержит только анионы (R~).

Рассмотрение хода титрования моноаминомонокарбоновой кислоты (рис. 4.6) позволяет сделать три важных вывода. Во-первых, все ?-аминокислоты при любых рН ведут себя как сильные электролиты. Различные формы аминокислот (катионы, биполярные ионы, анионы или комбинации этих форм) существуют в растворе в виде ионных солей. Многие свойства аминокислот более характерны для солей, чем для неионных органических соединений; к таким свойствам аминокислот относятся высокие температуры плавления, хорошая растворимость в воде и низкая растворимость в неполярных растворителях, подобных эфиру и хлороформу. Во-вторых, изоэлектрическая точка аминокислоты определяется значениями двух констант диссоциации. При рассмотрении кривой титрования (рис. 4.6) видно, что для моноаминомонокарбоновой кислоты изоэлектрическая точка равна среднему арифметическому p/G и р/Сг- В-третьих, растворы всех аминокислот обладают буферными свойствами, причем их буферная емкость максимальна при рН, равных значениям р/С кислотных групп. Например, раствор аминокислоты, кривая титрования которой показана на рис. 4.6, обладает высокой буферной емкостью при рН 2,3 (p/Ci) и рН 9,6 (р/Сг). Аминокислоты не проявляют буферных свойств в изоэлектрической точке.

Кривые титрования аминокислот, содержащих три кислотные группы, имеют три точки перегиба, соответствующие р/С каждой из этих групп. Титрование полностью протонированных форм таких аминокислот требует 3 экв. основания, как, например, в случае аспарагиновой кислоты:

соон соо- соо- соо-

CHNH3+ +ан\ CHNH3+ +он-. CHNH3+ +он- > CHNH2

сн2 ~+№ «jn, " +№ ^н2 * +н+ сн2

соон соон соо- (???-

? ц ш rv

Изоэлектрическая форма аспарагиновой кислоты соответствует структуре II, поскольку только она электронейтральна. Аналогично ионными формами лизина являются следующие:

соон соо- срог соо-

CHNR+ +ОН- (ZHNH+ -юн-. CHNH2 +??-, CHNH2 «р-Уз +н* (сн^з '+?' (СН2)3 ^"Л-Щ, CH2NH3+ CH.NH3+ CH2NH3+ CH2NH2

? и ш rv

118

I. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

Изоэлектрической форме лизина соответствует структура III. Для расчета р/ аминокислот полезно уравнение

р/=-2-

где ? — максимальное число положительных зарядов в полностью протонированной аминокислоте. Для аспарагиновой кислоты я=1, а для лизина ? = 2; для моноаминомонокарбоновой ?-аминокислоты также п=1. Используя значения р/С кислотных групп аминокислот, приведенные в табл. 4.1, можно легко вычислить р/ любой аминокислоты.

4.2.5. Химические свойства аминокислот

Аминокислоты вступают во многие химические реакции благодаря наличию в их молекулах нескольких реакционноспособиых групп. Алифатические моноаминомонокарбоновые кислоты проявляют химические свойства, типичные для карбоксильной группы и аминогруппы. Другие аминокислоты, кроме того, вступа