восстановления 02 может быть преодолен последовательным добавлением одиночных электронов. Поэтому одноэлектронные пути восстановления кислорода, в которых участвуют, свободнорадикальные промежуточные продукты, более вероятны, разумеется, при том условии, что они энергетически возможны. Полное восстановление 02 до 2Н20 требует 4 электрона; при одноэлектронном восстановлении в качестве промежуточных продуктов возникают супероксид ??, пероксид водорода Н20» и гидроксидный радикал (??·). Эти продукты очень реакционно-способны, и их присутствие может представлять угрозу для целостности живых систем. На самом деле ??· — наиболее мутагенный продукт ионизирующей радиации — представляет собой чрезвы-

520

III. МЕТАБОЛИЗМ

чайно мощный окислитель, который может атаковать все органические соединения. Одноэлектронное восстановление кислорода инициирует цепь реакций, которые ведут к образованию ??·:

02 + е-> Cv (1>

07-+Н+-» ?02· (2)

ОГ- + ?02· + Н+ -> н2о2 + О, (3>

07· + Fe3+ -»¦ Os + Fe«+ (4),

Н202 + Fe*+ -»- Fe3+ + ОН" + ОН- (5>

Супероксид-анион, образуемый в реакции (1), может протежироваться до гидропероксидного радикала [реакция (2)], так как HOj —кислота с рКа~4,8. Реакция (3) представляет собой спонтанную дисмутацию, приводящую к образованию Н202+02. Совокупность этих реакций дает основания предполагать, что любая система, продуцирующая ОТ, будет также вскоре содержать Н202-Реакции (4) и (5) указывают на то, что железосодержащие соединения могут катализировать реакцию между Of и Н2О2, образуя при этом ??·.

Как уже отмечалось, ксантиноксидаза,_альдегидоксидаза и многочисленные флавопротеиды образуют Of и Н202, что происходит и при самопроизвольном окислении гемоглобина, ферредоксинов, восстановленных цитохромом Ь$ гидрохинонов, тетрагидроптериди-нов и адреналина. Митохондрии и хлоропласты образуют Of Подобно полиморфноядерным лейкоцитам и макрофагам, участвующим в процессе фагоцитоза. Угроза для клеток, возникающая из-за реакционноспособности ОГ и Н202, устраняется действием ферментов, эффективно обезвреживающих эти соединения.

13.7.5. Супероксиддисмутазы

Супероксиддисмутазы катализируют реакцию

07- + 07 + 2Н+-> Н202 + о2

Эти ферменты найдены во всех дышащих клетках, а также в различных факультативно анаэробных бактериях. V max чрезвычайно высока и лимитируется только скоростью диффузии ОГ; константа скорости реакции второго порядка составляет ~2-109 моль-1-с-1. Супероксиддисмутазы — металлоферменты. Их каталитический цикл включает восстановление и окисление иона металла, например Си2+, Мп3+ или Fe3+, на активном центре (Е — фермент, ? — металл):

Е—Мл+ + 07- -»- ?—м(л_1'+ + Os (6)

Е_М(л-1>+ + ??- + 2Н+ -> ?—Мл+ + Н202 (7)

Фермент цитозоля клеток эукариот содержит ??2+ и Си2+ в активном центре в большой близости друг к другу. Фермент состо-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

521

ит из двух идентичных субъединиц (мол. масса 16 000). Структура фермента из бычьих эритроцитов приведена в гл. 6. В каталитическом окислительно-восстановительном цикле функционирует Си2+; роль ??2+ неясна.

Супероксиддисмутаза, содержащая Мп3+ и состоящая из субъединиц с мол. массой 20 000, найдена в бактериях и митохондриях эукариот. Такие же дисмутазы, содержащие Fe3+, а не Мп3+, обнаружены у некоторых бактерий и сине-зеленых водорослей. Только Си2+-2п2+-супероксиддисмутазы ингибируются цианидом. Тогда как цитоплазма и строма хлоропластов листьев шпината содержит Си2+-2п2+-фермент, другой, нечувствительный к цианиду фермент тесно связан с продуцирующим 02 центром и прочно встроен в ламеллу хлоропласта. Последовательности аминокислот Fe3+- и Мп3+-супероксиддисмутаз в значительной степени гомологичны. Си2+-2п2+-ферменты, очевидно, представляют собой независимую линию эволюционного развития. Близкое родство бактериальных и митохондриальных суперокснддисмутаз согласуется с теорией происхождения митохондрий из прокариот, которые вступили во внутриклеточный симбиоз с протоэукариотамн (гл. 27).

13.7.6. Ката лаза и пероксидазы

Каталазная активность наблюдается почти во всех животных клетках и органах. Печень, эритроциты и почки — богатые источники каталаз. Эта активность также обнаруживается во всех растительных материалах и в большинстве микроорганизмов, кроме облигатных анаэробов. В каждом случае каталаза, вероятно, предотвращает аккумуляцию вредного Н202, образуемого при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов и из Oj.

Пероксидазы катализируют следующую типичную реакцию:

Каталаза из печени быка (мол. масса 248 000) содержит четыре гемовых группы на молекулу фермента. Ее субъединнцы лишены ферментативной активности. Каталаза относится к числу ферментов с наиболее высоким числом оборотов. Одна молекула катала-зы может разложить 44 000 молекулы Н202 в секунду. Фактически фермент не требует почти никакой энергии активации, и скорость реакции, по-видимому, полностью определяется диффузией.

О

ОН

34—1148

522

III. МЕТАБОЛИЗМ

Каталаза реагирует с Н202 с образованием относительно стабиль-яого фермент-субстратного комплекса, структура которого не выяснена. Только в этой форме каталаза может реагировать со своим специфическим ингибитором 3-амино-1,2,4-триазолом.

Хотя пероксидазы встречаются относительно редко в животных тканях, в печени и почках обнаружена слабая пероксидазная активность; пероксидаза была выделена из молока. Лейкоциты содержат вердопероксидазу, которая ответственна за пероксидазную .активность гноя. Клетки фагоцитов содержат миелопероксидазу, которая окисляет ионы галогенов, например I-, до свободного галогена — эффективного бактерицидного агента. В эритроцитах имеется глутатионпероксидаза, содержащая Se и специфично окисляющая восстановленный глутатион. Дрожжи и плацента содержат пероксидазы, по-видимому специфичные к ферроцитохрому с, и у некоторых бактерий имеются пероксидазы, которые окисляют NADH. BGe высшие растения богаты пероксидазами. В исследовании пероксидаз в качестве исходного материала широко применялись хрен и репа.

В опытах по обнаружению скрытой крови в кале, моче и т. д. использовался показатель пероксидазной активности как критерий наличия гемопротеидов. Мельчайшие количества крови в присутствии пероксида катализируют окисление бензидина, гваяковой смолы и других веществ до окрашенных продуктов.

Возможно, наиболее эффективное использование пероксидаз происходит у жука бомбардира, который накапливает концентрированный раствор диокснфенола в ~25%-ном Н202 в одной железе и суспензию кристаллической пероксидазы — в другой' Когда на жука: нападают, он выбрасывает содержимое этих желез через напоминающую башенку трубку-смеситель. Взаимодействие настолько .интенсивно, что жидкие'продукты реакции имеют температуру 100°С.

Каталазную и пероксидазную реакции можно записать следующим образом:

НО

но,

о

2Н20 + ii

+

о

но

но

Тогда становится очевидной аналогия между этими двумя реакциями. В этом смысле каталазное расщепление Н202 на Н20 и 02 представляет собой особый случай пероксидазной реакции,- когда

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

523

пероксид водорода служит в качестве и субстрата, и акцептора. Эта аналогия становится более отчетливой, если учесть, что при высоких концентрациях спиртов с низкой молекулярной массой (или формальдегида) и низких концентрациях пероксида каталаза также обнаруживает пероксидазную активность. Оба фермента могут утилизировать как субстраты органические гндропероксиды с небольшими алифатическими заместителями, например гитро-пероксид этила и надуксусную кислоту. Ввиду того что в физиологических условиях могут существовать высокие концентрации других акцепторов и низкие концентрации пероксида, становится' понятным, что в животных тканях каталаза действует почти исключительно как пероксидаза. В свою очередь это вызывает сомнения по поводу сушествования какой-либо другой независимой пероксидазы в животных тканях, кроме глутатионпероксидазы.

Пероксидаза из хрена (мол. масса 44 000), содержащая группу гема на молекулу, реагирует с Н202 с последовательным образованием соединений, которые можно обнаруживать спектрофото-метрически (соединение I имеет максимум поглощения при 405 нм, а соединение II — при 425 нм). Предполагаемая реакция запишется следующим образом:

?—Н20 + Н202 -? Е—Н„02 + Н20

соединение I

?—Н202 + .МН2 -> соединение II + МН-

соединение ?? + ??· -*¦ ?—?,? + ?

Соединение I представляет собой окисленную форму фермента, в которой железо связано с пероксидом и несколько электронов* делокализованы, так что валентное состояние железа выше, чем' Fe3"1-. Затем соединение I превращается в соединение II и опять в исходный фермент в ходе последовательных одноэлектронных реакций, в которых субстрат сначала окисляется до свободного радикала, обнаруживаемого методом электронного парамагнитного^ резонанса, а затем полностью окисляется.

Литература Книги

Boyd С. S., Smcllie R. ?. S., eds.. Biological Hydroxylalion Mechanisms. Academic Press, Inc., New York. 1972.

Boyer P. D., ed., Oxidation-Reduction, vol. XI—XIII of The Enzymes, 3d ed.. Academic Press. Inc.. New York. 1975. 1976.

Chance В.. Estabrook R. W., Yonetani Т., eds.. Hemes and Hrmoproteins, Academic Press, Inc., New York, 1966.

Hayaishi O., ed., Molecular Mechanisms of Oxygen Activation, Academic Press Inc., New York, 1974.

34*

1524

III. МЕТАБОЛИЗМ

Keilin D., The History of Cell Respiration and Cytochromes. Cambridge University

Press, New York, 1966. King Т. E., Mason H. S., Morrison M., eds., Oxidases and Related Redox Systems,

University Park Press, Baltimore, 1973. Lemberg R., Barret J., Cytochromes. Academic Press, Inc., New York, 1973. Lovenberg W., ed.. Iron-Sulfur Proteins, Academic Press, Inc.. New York, 3 vols.,

1973, 1974, 1977.

Singer T. P., ed.. Flavins and Flavoproteins, Elsevier Scientific Publishing Co., Amsterdam, 1976.

¦Smith К. M.. Porphyrins and Mettaloporphyrins, Elsevier Publishing Co.. Amsterdam, 1975.

Sund H., ed.. Pyridine Nucleotide Dependent Dehydrogenases, Springer-Verlag, New

York, Inc.,