бдене происходит атака на субстрат, сопровождающаяся отщеплением гидрид-иона. Гидрид-ион замещается ионом гидроксида из среды

так что кислород введенного гидроксила происходит из воды, а не из 02.

Способ присоединения Мо6+ к белку неизвестен, но существуют данные, свидетельствующие о наличии в его окружении пер-сульфидных групп (—S—S~) (X в вышеприведенном уравнении реакции) и о том, что гидрид-ион каким-то образом поделен между ними. Электроны от восстановленной молибден-персульфидной структуры переносятся к FAD, который в свою очередь находится в контакте как с молибденом, так и с железосероцентром, так что окисленный фермент может принимать 5 или 6 электронов. На рисунке 13.16 показан спектр ЭПР восстановленной альтетидок-сидазы из печени кролика и видны сигналы, относящиеся к Мо5+, FADH', и (Fe3+)S-(Fe2+)3S3. Ксантиндегидрогеназч дает синий семихинон и восстанавливает 02 только по одноэлектронно-му механизму. Однако в условиях мягкой денатурации восстановленная форма фермента вместо этого образует FADH2, а затем

к—С: ? + ОН" + X

I ?

* R—С—ОН + ?.?

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

505

легко восстанавливает 02 до Н202. Растворимая ксантиноксидаза молока и альдегидоксидаза печени действуют сходным образом. Напротив, ксантиноксидаза липидов молока ведет себя скорее как печеночная ксантиндегидрогеназа и легко восстанавливает NAD+.

13.6.3. Медьсодержащие оксидазы

Некоторые окрашенные в синий цвет ферменты, имеющие в большинстве растительное происхождение и содержащие медь в качестве единственной простетической группы катализируют простое дегидрирование субстрата. Медьсодержащие оксидазы наиболее распространены в тканях млекопитающих (табл. 13.7), но вместе с тем к этой группе ферментов относятся и такие, как аскорбаток-сидаза тыквы и лакказа, впервые обнаруженная в лаковом дере-

Таблица 13.7 Некоторые медьсодержащие оксидазы

Оксидаза Продукт восстановления (j2 Молекулярная масса Число атомов Си на одну молекулу Источник

Аскорбатоксндаза н2о 135 000 8—10 Тыква

Лакказа н,о 110000 4—6 Лаковое дерево

Церулоплаз.чин 150 000 6—8 Человеческая

ротка

Уратоксидаза нао 120 000 1 Печень

Диаминоксидаза н2оа 185 000 2 Почки свиньи

Моноаминоксидаза наоа 1 200 000 8 Печень свиньи

Галактозооксидаза н2о2 60 000 1 Грибы

ве, а по современным данным широко распространенная в растениях и грибах. Лакказа катализирует двуэлектронное окисление о-н /7-диоксибензолов до соответствующих хинонов, восстанавливая при этом 02 до Н20. Аскорбатоксндаза окисляет аскорбат до де-гндроаскорбата (разд. 13.6.7) опять-таки с восстановлением 02 до Н20. Плазма крови содержит белок церулоплазмин небесно-голубого цвета, который сходным образом катализирует окисление гидрохинона и л-фенилендиамина до ?-хинона. Все эти ферменты обесцвечиваются своими субстратами и ингибируют-ся CN~. Судя по данным ЭПР-опектрометрии, медь в каждом из них связывается тремя разными способами, включая образование Си2+—Си2+-.пары с сопряженными спинами, которая не обнаруживается методом ЭПР. Механизм действия ферментов этой

33—1143

506

III. МЕТАБОЛИЗМ

группы до си.х пор неясен. 02 должен, очевидно, связываться либо с одиночной Си+, либо с парой Си+. Субстраты отдают один электрон с образованием свободно-радикальных промежуточных продуктов. Обнаружена по крайней мере одна промежуточная стадия, когда кислородный радикал, вероятно 02, связан с парой Си+. Показано, что Н20, связанная с медью в молекуле окисленного фермента, может обмениваться с Н20 из среды лишь после перехода фермента в восстановленную форму. В ходе реакции Н2Ог не появляется; таким образом, эти ферменты, подобно цитохром-оксидазе, осуществляют четырехэлектронное восстановление атмосферного кислорода.

Вторая группа — это бесцветные медьсодержащие оксидазы, медь которых связана иначе, чем в «голубых» белках; они восстанавливают 02 до Н202. В плесневых грибах, растениях, плазме крови найдены диаминоксидазы, которые в качестве субстратсвя-зывающего центра содержат пиридоксальфосфат (гл. 21); он образует шиффово основание с одной аминогруппой субстрата, тогда как другая аминогруппа окисляется до альдегида с выделением NH3. В печени свиньи имеется моноаминоксидаза, которая не содержит пиридоксальфосфата и окисляет разнообразные моноамины. Гриб Polysporus circinatus содержит галактозооксидазу, окисляющую галактозу при атоме С-6 с образованием галактозо-альдегида; Си2+ скоординирован с двумя имидазольными группами. Все вышеуказанные медьсодержащие ферменты инактивиру-ются специфическими связывающими медь реагентами, например диэтилдитиокарбаматом.

13.6.4. Диоксигеназы

Ферменты, катализирующие реакции, в которых оба атома молекулярного кислорода встраиваются в продукты реакции, называются диоксигеназами. Известные в настоящее время ферменты этой группы могут содержать в качестве активной группы гем или негемовое железо, а для действия некоторых, кроме того, необходим ?-кетоглутарат. Чаще всего диоксигеназы катализируют разрыв двойной связи в ароматическом кольце, однако и другие разнообразные реакции катализируются сходным образом.

13.6.4.1. Гемсодержащие диоксигеназы

Печень, а также клетки Pseudomonas содержат гемопротеид, который катализирует начальную стадию катаболизма триптофана, разрыв индольного кольца с образованием формил-ь-кинуре-нина (гл. 23). Один атом кислорода входит в формильную группу; другой образует кетогруппу. Для катализа требуется, чтобы в ге-мовом железе присутствовал Fe2+. Фермент медленно самоокисля-

13. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. II

ется и восстанавливается анионом супероксида (О?.). Родственный ему фермент — индолиламиндиоксидаза кишечника, который может оксигенировать индолиламины, например D-триптофан, се-ротонин и триптамин, не использует Ог, но требует анион супероксида, который восстанавливает железо и является активным окси-генирующнм началом.

13.6.4.2. Железосодержащие диоксигеназы

По крайней мере три четверти известных диоксигеназ содержат негеминовое железо. Красные ферменты, полученные из различных псевдомонад, которые могут катализировать интрадиоль-ную оксигенацию, содержат Fe3+. Типичной в этом отношении является пирокатехаза. Бесцветные экстрадиольные оксигеназы, например метапирокатехаза, содержат Fe2+, связанный с —SH-группой.

цис,цис -муконовая катехин полуагьЭегмЭ ??-окси

кислота муконовой кислоты

Гомогентизатоксигеназа печени (гл. 23) относится ко второй категории ферментов, нуждающихся в железе. Этот фермент легко теряет железо при очистке, но полная активность восстанавливается при добавлении Fe2+. Железосодержащие ферменты также катализируют оксигенирование сульфгидрильных соединений. Ферменты печени, которые окисляют цистеамин и цистеин до гипотау-рипа и ннстеинсульфиновой кислоты (гл. 23), содержат железо и, по-видимому, проявляют потребность в сульфиде.

Метаболизм тирозина (гл. 23) включает реакцию, в ходе которой л-окснфенилпировиноградная кислота превращается в гомо-гентизиновую кислоту под действием единственного фермента. Этот процесс включает миграцию группы —СН2СООН из пара- в лгега-положение относительно исходной гйдроксидной группы (гл. 23). Активный фермент обнаружен только в печени и почках. Фермент представляет собой тетрамер из идентичных субъединиц, и его активность определяется присутствием Fe2+. Когда для исследований метаболизма тирозина используется 1802, один меченый атом кислорода появляется во вновь образованной п-феноль-ной группе, а второй — во вновь образованной карбоксильной группе. Механизм необычного перемещения боковой цепи требует выяснения.

33*

508

III. .МЕТАБОЛИЗМ

Железо-а-кетоглутаратдиоксигеназы. Некоторые железозави-симые ферменты катализируют гидроксилирование субстрата в ходе процесса, в котором ?-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию до сукцината. Один из двух атомов кислорода от молекулы 02 появляется в новой гидроксидной группе субстрата, а другой — в одном из кислородных атомов новой карбоксильной группы сукцината. В тканях животных эта группа ферментов включает те ферменты, которые гидроксилируют положение 4 остатков пролина и положение 5 некоторых лизиновых остатков в проколлагене (гл. 38) и которые превращают ?-бутиро-бетаин в карнитин (гл. 22). Аскорбат служит в качестве восстановительного агента для поддержания железа в ферменте в двухвалентном состоянии. Пролил- и лизилокснгеназы могут гидрокси-лировать свои субстраты только тогда, когда они находятся в типичных аминокислотных последовательностях проколлагена. Процесс в целом может быть изображен как

Fea+

? -4- Оа + ?-кетоглутарат->- ?—ОН + сукцинат -4- СО„.

* диоксигеназа '

Распространение этого класса ферментов подвергалось систематическому исследованию. Примечательно, что как Neurospcra crassa, так и Rhodotorula содержат ферменты, которые используют этот механизм для гидроксилирования метильной группы тимина с образованием 5-оксиметилурацила и, что наиболее удивительно, для гидроксилирования 2'-углерода дезоксирибозы как тимидина, так и дезоксиуридина.

В табл. 13.8 обобщена информация о некоторых диоксигеназах, которые обсуждались выше.

13.6.5. Монооксигеназы

Живые организмы содержат группу многочисленных и разнообразных ферментов, получивших обшее название монооксигеназ. В типичном случае один атом кислородной молекулы обнаруживается в новой гидроксидной группе субстрата, другой — восстанавливается до воды в процессе реакции. В соответствии с этим реакция должна протекать при участии фермента, субстрата, 02 и какого-либо восстанавливаюшего агента. В литературе такие ферменты раньше назывались гидроксилазами или оксидазамн со смешанными функциями.

13.6.5.1. Медьсодержащие монооксигеназы

Допамин-$-монооксигеназа, присутствующая в мозге и в хром-аффинной ткани, катализирует гидроксилирование 3,4-диоксифе-нилэтиламина до норадреналина (гл. 45). Димеры идентичных мо-

Таблица 13.8 Некоторые диоксигеназы

СуСстрат Продукт Молекулярная масса Простетнческап группа Источник

L-Тр