Биологический каталог




Клетки иммунной системы

Автор А.А.Тотолян, И.С.Фрейдлин

ения нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Нитросиний тетразолий имеет исходный желтый цвет, но под влиянием супероксидных радикалов он превращается в формазан темно-синего цвета. Накопление формазана регистрируется в экстракте из моноцитов спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Другой вариант учета НСТ-теста микроскопический: подсчет доли форма-занположительных моноцитов, содержащих темно-синие зерна. При фагоцитозе опсонизированных частиц зимозана или при добавлении к клеткам бактериального ЛПС, или форболмиристатацетата (ФМА), продукция супероксидных радикалов резко возрастает, что отражается увеличением доли формазанположительных клеток и количества формазана в экстракте моноцитов.

Для оценки кислороднезависимых механизмов внутриклеточной микробицидности моноцитов используется метод определения содержания лизосом в цитоплазме моноцитов. Содержание лизосом в моноцитах оценивают с помощью их прижизненной окраски люминесцентным красителем — акридиновым оранжевым, который избирательно накапливается в лизосомах, окрашивая их в ярко-красный цвет. С помощью люминесцентной микроскопии окрашенных препаратов оценивают суммарный индекс люминесценции моноцитов, который отражает содержание лизосом в их цитоплазме. Другие варианты оценки содержания лизосом связаны с цитохимическим определением активности внутриклеточных ферментов: кислой фосфатазы или неспецифической эстеразы.

8.5. Методы оценки продукции и уровней цитокинов

Существует три различных подхода к количественному определению цитокинов: иммунохимический (ИФА=ЕЫ8А), биотестирование и молекулярно-биологические тесты для выявления тРНК соответствующего цитокина.

Биологическое тестирование — самый чувствительный метод, к тому же единственный, позволяющий получить информацию о биологической активности молекул цитокина. Однако биотесты трудоемки, длительны и недостаточно специфичны, уступая в этих отношениях иммунохимическому подходу (ИФА). Различают четыре разновидности биотестирования: по цитотоксическому эффекту, по индукции пролиферации, по индукции дифференцировки и по противовирусному эффекту. По способности индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование следующих цитокинов: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7. По цитотоксическому действию на чувствительные клетки-мишени (L929) тестируют TNF-a и TNF-(3. Колониестимулирую-щие факторы оценивают по способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в мягком агаре. IFN-y выявляют по способности индуцировать экспрессию HLA II класса на клетках-мишенях. Биотест на IL-8 основан на его способности усиливать хемотаксис нейтрофилов. Оценка противовирусной активности позволяет выявить интерфероны, а принадлежность интерферона к определенному типу определяют с помощью реакции нейтрализации, т. е. ингибиции антивирусного действия специфическими моноклональными антителами.

Для иммуноферментного определения уровня цитокинов во многих случаях используют стандартные коммерческие наборы, содержащие «посадочные» моноклональные антитела, которые связывают цитокин, биотинилированные моноклональные антитела и выявляют первую реакцию связывания, а также систему цветной реакции, например комплекс: стрептавидин—фермент—субстрат фермента. Преимущества этого метода: специфичность, быстрота, простота. Однако он уступает биотестированию по чувствительности и не позволяет различить активные и неактивные формы цитокинов. Иммуноцитохимическим методом удается выявить цитокины не только в биологических жидкостях, но и в срезах тканей.

Молекулярно-биологические методы позволяют определить экспрессию цитокиновых генов в исследуемом материале, т. е. присутствие соответствующей mPHK. Как правило, гены цитокинов не экспрессируются конститутивно, транскрипция этих генов регулируется соответствующими индуцирующими молекулами. Кроме того, mPHK очень короткое время присутствует в клетке. При ее выделении необходимо принять меры предосторожности против ее деградации. Наиболее чувствительным считается поли-меразная цепная реакция (PCR), а метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессии цитокиновых генов.

Кроме исследования содержания цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях, дополнительную информацию можно получить при изучении способности клеток к продукции цитокинов. Изучение продукции цитокинов в культурах цельной крови или выделенных из крови мононуклеаров позволяет охарактеризовать секреторную активность моноцитов крови, индуцированную стандартными митогенами: конканавалином А, фитогемаг-глютинином или ЛПС. При этом секреция цитокинов оценивается путем исследования надосадочной жидкости с помощью ИФА или биотестов. Для оценки функциональной полноценности моноцитов крови наиболее адекватно определение их ответа на ЛПС и на IFN-y секрецией провоспалительных цитокинов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С, Воробьев А. А. Эндогенные им-муномодуляторы. СПб., 1992. 255 с.

2. Кон

страница 98
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104

Скачать книгу "Клетки иммунной системы" (1.72Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.11.2017)