Биологический каталог




Клетки иммунной системы

Автор А.А.Тотолян, И.С.Фрейдлин

цельная кровь используется, как правило, для проведения ориентировочных тестов оценки миграционной, фагоцитарной и метаболической активности моноцитов, а также при современных методах изучения поверхностного фенотипа моноцитов с помощью проточной флуориметрии (FACS). При оценке продукции цитокинов также нередко используется цельная кровь, хотя при этом не удается точно идентифицировать клетки-продуценты.

8.1. Способы выделения моноцитов крови

Для выделения мононуклеаров крови наиболее широкое распространение получил метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (с плотностью 1.077 г/см3). После центрифугирования образуется осадок эритроцитов и гранулоцитов на дне пробирки, над ним находится слой смеси фиколл-верографин, а на границе между этим слоем и верхним слоем плазмы крови располагается тонкий слой (в виде кольца) мононуклеаров крови, которые отличаются от других форменных элементов значительно меньшей плотностью. После отмывания мононуклеаров от смеси фиколл-верографин и от плазмы подсчитывают количество выделенных клеток, среди которых обычно 70—90 % составляют лимфоциты, а на долю моноцитов приходится от 10 до 30 % (примесь гранулоцитов не должна превышать 2 %, жизнеспособность выделенных клеток, по данным теста с трипановым синим, должна быть не ниже 98 %).

Для выделения моноцитов из суммарной фракции мононуклеаров самый простой и доступный метод основан на избирательной способности моноцитов (в отличие от большинства лимфоцитов) быстро и прочно прикрепляться к поверхности стекла или пластика. Инкубация смеси моноцитов с лимфоцитами в течение 2—24 ч используется для их разделения на прилипающую (моноциты) и неприлипающую (лимфоциты) фракции.

Более точными, но при этом более дорогими, требующими специальной аппаратуры, являются методы разделения моноцитов и лимфоцитов в специальных градиентах плотности, или метод элютриационного центрифугирования.

Современным методом освобождения смеси клеток от лимфоцитов является обработка смеси клеток моноклональными антителами против антигенов, присутствующих только на лимфоцитах, с последующим их комплементзависимым лизисом. Использование моноклональных антител позволяет разделить моноциты и лимфоциты с помощью флуоресцентно активированного клеточного со-ртера (FACS). Но эти методы отличаются дороговизной.

8.2. Методы оценки адгезии моноцитов

Способность моноцитов прикрепляться к стеклу и пластику используется для их выделения. Вместе с тем адгезивные свойства моноцитов могут изменяться, что позволяет использовать тест адгезии моноцитов к стеклу или пластику для оценки их функциональной активности. В основу различных технических вариантов тестов адгезии положена инкубация клеток в условиях, позволяющих им прикрепиться к определенной поверхности с последующим их количественным учетом.

Значительно больший интерес представляет изучение адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам, что отражает их адгезионное поведение внутри кровеносных сосудов. В этом случае используют первичную или перевиваемую культуру эндотелиальных клеток, на поверхность которой наслаивают взвесь моноцитов. После инкубации и отмывания неприлипших клеток количество адгези-рованных моноцитов определяют, выявляя специальной окраской фермент миелопероксидазу и проводя спектрофотометрическую оценку количества этого фермента.

Наиболее точным и информативным является современный метод выявления и количественной оценки экспрессии на мембране моноцитов адгезионных молекул с помощью соответствующих моноклональных антител и метода проточной флюориметрии, который позволяет оценить долю клеток, экспрессирующих ту или иную молекулу адгезии. Таким же методом оценивают поверхностный фенотип моноцита в целом, включая экспрессию основных рецепторов, костимулирующих молекул и других антигенов (см. табл. 4). Наиболее существенным для адгезии моноцитов к эндотелию считается взаимодействие между Р2-интегринами CDlla/CD18 и CD1 lb/CD 18 молекулами на мембране моноцита и соответствующими лигандами — межклеточными адгезионными молекулами (ICAM-1 и ICAM-2) — на поверхности эндотелиальных клеток. Экспрессию CD11/CD18 на моноцитах оценивают, используя моноклональные антитела против а- или Р-цепей гетеродимера. Комплекс CD11/CD18 существует в трех формах, которые имеют разные а цепи: a, b и с, которые нековалентно соединены с общей для всех p-uenbio-CD18 [92].

8.3. Методы оценки локомоторных функций моноцитов

В течение нескольких лет для изучения рекрутирования моноцитов крови в очаг асептического воспаления «in vivo» успешно использовался метод «кожного окна» по Ребаку, позволяющий оценить активность мобилизации фагоцитирующих клеток в очаг асептического воспаления на месте искусственного повреждения кожи, непосредственно в организме человека. В первые 3 ч после нанесения повреждения оценивается мобилизация нейтрофилов, а через 18—20 ч оценивается рекрутирование моноцитов/макрофагов. Метод подкупал своей простотой и доступностью при достаточн

страница 96
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104

Скачать книгу "Клетки иммунной системы" (1.72Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.06.2017)