объекта фагоцитоза используют частицы полистирольного латекса, убитые нагреванием клетки бактерий или дрожжей. К выделенной фракции гранулоцитов, или нефракционированной лейковзвеси, или цельной крови добавляют суспензию вышеперечисленных частиц, инкубируют, готовят мазок и после окрашивания препарата учитывают количество нейтрофилов, участвовавших в фагоцитозе. Определяют фагоцитарное число — процент фагоцитирующих нейтрофилов, фагоцитарный индекс — среднее число частиц (латекс, бактерии, дрожжи), фагоцитированных каждым нейтрофи-лом.

Учитывая нарастающую проблему системных микозов у больных с дефектами функциональной активности нейтрофилов, актуальным является изучение фагоцитоза грибов Candida albicans. В качестве объекта фагоцитоза используются живые С. albicans, а доля выживших дрожжей измеряется на основе свойства не окрашиваться метиленовым синим. Суспензию нейтрофилов в присутствии пулированной сыворотки доноров (выполняющей роль опсо-нинов) смешивают с С. albicans и инкубируют при постоянном вращении. Через 1 ч после начала инкубации добавляют раствор дезоксихолата натрия, а затем раствор метиленового синего. Клетки отмывают на холоду, осадок ресуспензируют, готовят препарат и окрашивают. Мертвые дрожжевые клетки окрашиваются в темно-синий цвет, их подсчитывают и результаты выражают в процентах от всего количества клеток.

Одним из современных методов является оценка поглощения стафилококка нейтрофилами периферической крови, внутриклеточной бактерицидности нейтрофилов с применением проточной цитометрии [9]. Живые стафилококки метят ФИТЦ с максимальным сохранением антигенных свойств микроорганизма. Такие частицы можно длительно хранить в замороженном состоянии и использовать как для реакции поглощения, так и для определения внутриклеточной бактерицидности. Реакция поглощения ставится при соотношении нейтрофилы : стафилококк, равном 1 : 5, при 37 °С в течение 30 мин. Для разграничения прилипших и поглощенных бактерий используется гашение внеклеточной люминесценции производным таниновой кислоты. Внутриклеточную бактерицидность оценивают в течение 1 ч после предварительной постановки реакции поглощения бактерий фагоцитами в течение 20 мин при 37 °С (соотношение нейтрофилы : бактерии = 1 : 5) и двухкратной отмывки. Гранулоциты разрушают гипотоническим шоком. Бактерии анализируются на проточном цитометре по двойной метке: зеленая — для выделения их из детрита, красная (про-подиум иодид) — для дифференцировки убитых и живых.

8.5. Бактерицидность

Одним из наиболее распространенных тестов, отражающих кислородзависимый метаболизм нейтрофилов, является тест с ни-тросиним тетразолием (НСТ). Принцип метода заключается в том, что, сталкиваясь с активированным нейтрофилом, НСТ восстанавливается в диформазан, который в виде гранул, нерастворимых в воде и большинстве органических растворителей, откладывается внутри или на поверхности клеток [5, 10, 216]. Количество выпавшего диформазана служит критерием интенсивности реакции. Его можно проэкстрагировать горячим пиридином, диоксаном, диме-тилсульфоксидом и затем учесть реакцию на спектрофотометре, но чаще пользуются обычной микроскопией, подсчитывая процент нейтрофилов, содержащих диформазан. Кроме нейтрофилов НСТ восстанавливается в моноцитах и тромбоцитах, однако их влияние на учет результатов исключают, контрастируя ядра любым красителем, который по цвету отличается от диформазана. Нейтрофилы крови в норме находятся в неактивированном состоянии, поэтому в основном не восстанавливают НСТ. Число нейтрофилов, содержащих диформазан, у здоровых людей не превышает 10—15 %. Этот показатель называется спонтанным НСТ-тестом. Для оценки функциональных резервных возможностей нейтрофилов используют НСТ-тест в присутствии различных стимуляторов. Такой тест называется индуцированным НСТ-тестом. Существенным достоинством НСТ-теста является то, что он выявляет компоненты, которых нет (или почти нет) в покоящемся нейтрофиле. Они возникают только при стимуляции и поэтому дифференцируют интактные и активированные нейтрофилы.

В каждую лунку плоскодонного планшета вносят по 100 мкл рабочего разведения нейтрофилов. Для оценки индуцированного НСТ-теста в лунку вносят индуктор (форболмиристат ацетат, ЛПС, объект фагоцитоза). После инкубации при 37 °С в течение 1 ч надосадок удаляют, осадок высушивают, фиксируют этанолом 10 мин. Для растворения гранул диформазана в каждую лунку вно-

4 А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин сят диметилсульфоксид и учитывают реакцию на планшетном фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 640 нм. Высчитывают индекс стимуляции как отношение индуцированного НСТ-теста к спонтанному.

При микроскопическом учете методику ставят на предметных стеклах во влажной камере. После инкубации выделенных нейтрофилов или цельной крови с НСТ готовят мазки, окрашивают и оценивают количество формазанположительных нейтрофилов, выделяя среди них следующие группы:

. нейтрофилы без гранул диформазана, с единичными гранулами или с площадью, окраш