Биологический каталог




Клетки иммунной системы

Автор А.А.Тотолян, И.С.Фрейдлин

в присутствии хемоаттрактантов (не существует градиента концентрации хемоаттрактанта);

¦ хемотаксис — направленная миграция клеток при наличии градиента концентрации растворимого хемоаттрактанта;

Таблица 18

Общая характеристика методов для оценки локомоторных функций нейтрофилов

Методы постановки Методы учета реакции Тест-система

Из капилляра Микроскопический: Выделенная фракция

В капилляре по конечной точке гранулоцитов кро-

Под агарозой По «лидирующему фронту» ви

Из микрокапли агарозы Визуальный с компьютерным ана- Нефракционирован-

В камере Бойдена лизом ная лейковзвесь

ИФА Цельная кровь

По содержанию миелопероксидазы

Радиоизотопный

. гаптотаксис — направленная миграция клеток к хемоаттрак-танту, связанному с твердой фазой.

Для оценки локомоторных функций существует множество модификаций методов [47, 138, 172, 234, 259], которые можно сгруппировать следующим образом (табл. 18).

8.3.1. Методы in vitro. В 1962 г. Бойден предложил использовать микропористые фильтры для анализа лейкоцитарного хемотаксиса. С тех пор эта методика многократно модифицировалась, однако ее принципы оставались неизменными. В настоящее время за рубежом этот методический подход является наиболее распространенным и стандартизированным [259]. Для его реализации фирма Neuroprobe, Inc. (США) выпускает 48-луночную микрокамеру (модифицированная камера Бойдена), которая является высокопрецизионным прибором. Лейкоцитарную суспензию или гепаринизированную кровь помещают в одно отделение камеры, хе-моаттрактант — в другое, отделенное от первого микропористым фильтром. Размеры пор при этом должны быть таковы, чтобы клетки могли активно мигрировать, но не могли пассивно проходить из одного отделения камеры в другое. Этим способом можно анализировать практически все виды локомоторных функций: спонтанную миграцию, хемотаксис, хемокинез, гаптотаксис.

В нижнее отделение камеры Бойдена вносят раствор Хенкса (или иную среду, в которой ресуспензированы клетки) или хемо-аттрактант (табл. 19). Фильтры, смоченные раствором Хенкса, помещают в камеру Бойдена и собирают ее. В верхнее отделение камеры вносят клеточную суспензию в присутствии контрольной среды или изучаемых факторов. Камеру инкубируют 30 мин при 37 °С в присутствии 5 %-ного С02. Фильтры фиксируют, окрашивают и подсчитывают процент мигрировавших (прошедших через фильтр) нейтрофилов.

Принципиально иным является метод оценки локомоторных функций нейтрофилов под агарозой по Нельсону [234]. Предварительно готовят чашки Петри со стандартными лунками в агарозТаблица 19

Принципиальная схема изучения локомоторных функций нейтрофилов в камере Бойдена

Локомоторная функция Верхнее отделение камеры Фильтр Нижнее отделение камеры

Спонтанная миг- Клетки Смочен раствором Раствор Хеикса или

рация Хенкса контрольная среда

Хемотаксис » Хемоаттрактант

Хемокинез Клетки + хемо- »

аттрактант

Гаптотаксис Клетки Пропитан хемоат- Раствор Хенкса или

трактантом контрольная среда

ной среде. В лунки вносят суспензию клеток или хемоаттрактант (табл. 20), инкубируют 4 ч при 37 °С в присутствии 5 %-ного С02. Клетки фиксируют формалином, агарозу удаляют и чашки тщательно отмывают. Результаты оценивают при микроскопии чашек в темном поле, измеряя зону миграции с помощью шкалы окуляр-микрометра в усл. ед. Для оценки хемотаксиса (рис. 11) измеряют зону миграции клеток в сторону хемоаттрактанта (А) и в сторону контрольной среды (В) и определяют величину хемотаксиса (XT) по формуле:

XT = А/В.

Среди хемоаттрактантов, используемых в методе в качестве стандартного стимула, обычно применяются С5а (или зимозан-ак-тивированная сыворотка), синтетический фактор f-MLP и реком-бинантный IL-8.

Учет результатов в этой методике имеет целый ряд особенностей. Плотность клеток в пределах зоны миграции снижается по мере увеличения расстояния от края центральной лунки, и определение ее крайней точки становится субъективным. Если учитывать каждую мигрирующую клетку, то даже единичная клетка, локализованная далеко от остальных, может вызвать существенное иска-

Таблица 20

Принципиальная схема изучения локомоторных функций нейтрофилов

под агарозой

Локомоторная Лунки в агарозной среде функция 1 2 3

Спонтанная миграция Хемотаксис Хемокинез Клетки больного Хемоаттрактант » Раствор Хенкса или контрольная среда Клетки больного Клетки больного + хемоаттрактант Клетки здорового Раствор Хенкса или контрольная среда Хемоаттрактант Рис. 11. Схема оценки хемотаксиса.

/ — хемоаттрактант, 2 — клетки больного, 3 — контрольная среда (остальные объяснения в

тексте и табл. 20).

жение результатов. По этой причине такие клетки можно не учитывать. Определение «фронта миграции» является одним из ключевых этапов учета результатов. Несмотря на широкое применение этого метода в фундаментальных исследов

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104

Скачать книгу "Клетки иммунной системы" (1.72Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.05.2017)