Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

связывает либо АДФ, либо АТФ), то для •осуществления реакции (5) необходимо существование по крайней мере двух мест связывания нуклеотидов молекулой фермента. Как ¦было отмечено выше, структурных ограничений для рассмотрения обеих возможностей не существует (Fi способен связывать до 6 нуклеотидов на молекулу" фермента). Схемы (4) и (5) можно различить кинетически, по зависимости кажущейся константы скорости активации фермента (Анаб) от концентрации АТФ. В первом случае

- ?наб = &1 (6)

и не зависит от АТФ. Во втором

_ fe-2-[ATO] m наб ~ [АТФ]+Какт'

где какт = 1

0

32

Сравнение выражений (6) и (7) показывает, что, если активация фермента происходит по механизму (7), следует ожидать зависимости скорости активации от концентрации АТФ согласно уравнению Михаэлиса. Экспериментальные результаты показали, что на самом деле скорость активации гиперболически зависит от концентрации АТФ; значение константы скорости первого порядка для распада тройного комплекса (насыщающие концентрации АТФ) равно 2 мин-1 (25° С), а величина /Сакт~1 • 10-1 М и совпадает со значением константы Михаэлиса, измеренной в тех же условиях, что для АТФазной реакции. Сказанное дает основание полагать, что: 1) при образовании Е-АДФ-комплекса ингибитор не связан в центре фермента, из которого АДФ отщепляется в ходе гидролиза АТФ (если бы это было так, то число оборотов АТФазы было бы 2 мин-1, тогда как реальные величины имеют порядок ЫО4 мин-1); 2) АТФ связывается с одним и тем же центром фермента в ходе как каталитического акта, так и активации фермент-ингибиторного комплекса.

Величина «спонтанной», АТФ-независимой константы скорости активации фермента была определена следующим образом. Фермент блокировали АДФ (концентрации Е и АДФ подбирали таким образом, чтобы в системе практически не оставалось ни свободного фермента, ни свободного ингибитора, что легко достижимо, так как константа диссоциации равна 2-10_8М), добавляли большой избыток пируваткиназы и фосфоенолпирувата и во времени определяли появляющуюся по ходу инкубации АТФазную активность (начальные скорости реакции). Определяемая таким образом константа первого порядка скорости диссоциации Е-АДФ комплекса оказалась равной —0,2 мин-1, т. е. на порядок меньше, чем константа скорости диссоциации тройного комплекса АТФ-Е-АДФ (2 мин-1). Другими словами, связывание АТФ в активном центре •АТФазы вызывает 10-кратное ускорение диссоциации АДФ из центра, где последний связывается с высоким сродством.

Для анализа событий, происходящих при диссоциации АДФ из тройного комплекса, воспользуемся следующей схемой:

(3) ± ЛДФ

(1) ± АТФ

К,

¦?-АТФ

к.

АДФ-?-

к,

(4)

АДФ

(8)

ЬАТФ<2>

--• АДФ-?-АТФ

Существование реакции (/) следует из сродства фермента к АТФ при гидролизе последнего (Ki = 10-4 М), реакции (3) — из экспериментально наблюдаемого образования комплекса фермента с АДФ, где последний связан в центре, отличном от ката-

2 Заказ 423

33

литического, реакций (J?) и (4) — из кинетики АТФ-зависимой активации АТФазы, блокированной АДФ. Как было указано, Ki = K2 (связывание АДФ не влияет на сродство фермента к АТФ, хотя и блокирует его гидролиз); в силу замкнутости цикла (8) это означает, что Кз = К4 или, другими словами, сродство АДФ к ферменту не зависит от присутствия АТФ в каталитическом центре. Экспериментально, однако, показано, что константа скорости диссоциации АДФ из тройного комплекса, входящая в К4 (?-4). на порядок больше таковой для комплекса Е-АДф и входящей в Кз (&-з)- Условие Кз=К4 может, таким образом, сохраняться только, если предположить, что связывание АТФ увеличивает константы скоростей связывания и отщепления АДФ в одно и то же число раз:

К3 = К4; 4^-1ГТ> *-.= (9)

k-з k-t]

Следовательно, ki должно быть равно \0k3. Величина k3, рассчитанная нами с использованием экспериментально определенных Ка и &_з, равна 107-М-1 мин-1 [50], т. е. близка к верхнему пределу констант скоростей образования специфических комплексов фермента с лигандами [65,66]. Поэтому предположение об увеличении скорости связывания АДФ под действием АТФ мало вероятно. Гораздо более естественной кажется возможность, согласно которой ускорение диссоциации АДФ, вызванное АТФ, обусловлено медленным гидролизом АТФ в активном центре фермента. АТФ-за-висимая активация АДФ-блокированной АТФазы тогда может быть представлена следующей схемой:

+АТФ —Фи -АДф

АДФ - Е ¦>---> АДФ • Е • АТФ«--— * АДФ ¦ Е ¦ АДФ----

быстро медленно быстро

(k=2 мин-1)

-> ?АДФ. (10>

(интермедиат АТФазной реакции)

Подтверждением (но не доказательством!) такого механизма служат экспериментальные наблюдения, согласно которым скорость активации фермента, преинкубированного в присутствии высоких концентраций АДФ (условия образования комплекса АДФ-Е-АДФ, схема 10), значительно больше, чем скорость этого процесса для комплекса Е-АДФ. В нашей первой публикации это явление было представлено в виде снятия тормозящего эффекта, низких концентраций АДф высокими (см. рис. 3 в работе [48]), однако более детальное, хотя и недостаточное для публикации исследование этого явления показало, что кажущаяся активация фермента высокими концентрациями АДФ обусловлена лишь резким увеличением скорости его активации; начальная скорость гидролиза АТФ в обоих случаях равна нулю [67].

АТФ-зависимая активация АДФ-блокированной мембранно-

34

связанной АТФазы, естественно, поднимает вопрос о возможном вовлечении мембранного потенциала в этот процесс. Однако мы показали, что ни искусственное сопряжение AS-частиц низкими концентрациями олигомицина [68], ни добавление разобщителей не меняют кинетики активации фермента.

Влияние АДФ на окислительное фосфорилирование [53]. Изучение влияния АДФ на АТФазную реакцию, катализируемую мито-хондриальным АТФ-синтетазным комплексом, представляет интерес главным образом потому, что АДФ — субстрат окислительного фосфорилирования. Можно предположить, что, если АДФ является аллостерический эффектором фермента, блокирующим АТФазную реакцию, насыщение АДФ-специфичного центра связывания лигандом должно отразиться и на процесс окислительного фосфорилирования. С другой стороны, если АДФ-специфичный центр «регулирования» АТФазной активности представляет собой активный центр АТФ-синтетазы, начальные скорости процесса окислительного фосфорилирования будут одинаковыми в обоих случаях: когда реакция начинается внесением свободного фермента или фермент-субстратного комплекса. Для выбора между этими возможностями мы сравнили кинетику АТФазной и АТФ-синтетазной реакций, катализируемых субмитохондриальными частицами. Оказалось, что в условиях, когда гидролиз АТФ происходит с отчетливым лаг-периодом, индуцированным АДФ (измерение с АТФ-регенерирующей системой), скорость окислительного фосфорилирования (измерение с АДФ-регенерирующей системой) постоянна во времени. Другими словами, АТФ-синтетазный комплекс, АТФазная активность которого полностью блокирована АДФ, способен катализировать реакцию окислительного фосфорилирования. Ясно, что оба направления р

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)