Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

но используется при анализе АТФазных реакций, катализируемых различными митохондриальными препаратами; следует, однако, отметить, что альтернативные точки зрения время от времени предлагались различными авторами [29—33].

В последние годы из нескольких лабораторий появились сообщения о «релаксационном» поведении Fi-АТФазы.^ {34—43]. Под-

29

релаксационным, или «гистерезисным», поведением понимают медленные во времени (на порядок и более меньшие, чем время, необходимое для одного оборота в каталитическом акте) изменения активности фермента. Значимость экспериментально наблюдаемого релаксационного поведения Fi-АТФазы in vivo в настоящее время неизвестна. В то же время сам факт его существования вносит существенные особенности в трактовку кинетических экспериментов, направленных на изучение механизма реакций синтеза и гидролиза АТФ.

Несколько лет назад в нашей группе было обнаружено, что АДФ — субстрат окислительного фосфорилирования — вызывает необычное торможение АТФазной активности, по ряду параметров принципиально отличающееся от обычного конкурентного тормо-- жения [46, 47] и по всем параметрам соответствующее понятию о гистерезисных явлениях в энзимологии [44, 45]. Детальное изучение взаимодействия митохондриальной АТФазы с АДФ было предметом исследования нашей группы в течение последних четырех лет. Результаты этих работ опубликованы [48—55] и были доложены на нескольких конференциях.

В объеме обычных журнальных публикаций, посвященных экспериментальным исследованиям, не принято обсуждать более общие, чем это вытекает из конкретных результатов, положения. Цель настоящего очерка — кратко суммировать наши опубликованные результаты и дать более или менее развернутое обсуждение вытекающих из них рабочих гипотез, проверка которых, по нашему мнению, полезна для понимания механизма окислительного фосфорилирования. Основные сведения об АТФазной реакции, необходимые для такого обсуждения в очень краткой форме, даны выше. Более детальную информацию о митохондриальной АТФазе читатель может найти в ряде исчерпывающих обзоров {56—60].

Взаимодействие АДФ и митохондриальной АТФазы

Торможение АТФазы низкими концентрациями АДФ [48, 49]. При измерении АТФазной активности субмитохондриальных частиц, освобожденных от белкового ингибитора (AS-частицы [61]), в системе, где происходит накопление АДФ (регистрация реакции по изменению активности ионов водорода '[62]:

АТФаза

АТФ-* АДФ-3 + Ф7 + Н+), (2)

мы обнаружили, что при концентрации АТФ30

исходному, к системе, в которой начальная скорость реакции сильно заторможена, вызовет в начальный момент времени удвоение скорости гидролиза АТФ, так как скорость ферментативной реакции в присутствии субстрата и конкурентного ингибитора прямо пропорциональна концентрации фермента. Однако оказалось, что это не так. Повторное добавление AS-частиц к реакционной смеси приводило к резкой (значительно большей, чем двукратной) активации гидролиза, и скорость реакции затем быстро уменьшалась, как и после добавления первой порции фермента. Другими словами, создавалось впечатление, что в среде измерения активности происходит быстрая необратимая инактивация АТФазы.

Контрольные эксперименты показали, что ни неорганический фосфат, ни увеличение концентрации Н+, ни убыль субстрата, ни преинкубация фермента в течение времени измерения не приводят к торможению АТФазной активности AS-частиц. На основании ' этих простых опытов мы предположили, что АДФ «необратимо» тормозит АТФазу. Для подтверждения этого предположения мы. воспользовались следующим приемом. Субмитохондриальные частицы преинкубировали с АДФ и определяли их начальную АТФаз-ную активность в системе, которая обеспечивает необратимое удаление АДФ, образующейся в ходе реакции

лактатде-

АТФаза АТФ гидрогеназа

АТФ--¦* АДФ--» пируват--»лактат (3)

—Ф -(-фосфоенол- НАД- Н

пируват

при большом избытке пируваткиназы, лактатдегидрогеназы и их субстратов.

Такая система обеспечивает постоянный уровень АТФ, а скорость ее гидролиза легко прослеживается по изменению концент-

¦ рации НАД-Н [63]. Оказалось, что в этой системе при измерении активности фермента, преинкубированного с АДФ, наблюдается отчетливая лаг-фаза в образовании продуктов реакции: другими

.словами, скорость диссоциации АДФ из неактивного Е-АДФ-комп-лекса достаточно низка для того, чтобы ее можно было измерить обычными методами. По величинам начальных скоростей реакций, катализируемых препаратами, преинкубированными с различными концентрациями АДФ, легко определить константу диссоциации фермент-ингибиторного комплекса; она оказалась равной 2-10~8 М1. В дальнейшем было показано, что аналогичная картина наблюдается и при использовании растворимого фактора Fi. Влия-

,ние АДФ специфично: преинкубация АТФазы с другими нуклео-зиддифосфатами (ГДФ, ИТФ), .взятыми как в низких, так и в высоких концентрациях, не влияет на кинетику гидролиза АТФ. Гидролиз других нуклеозидтрифосфатов (ГТФ, ИТФ) после пре-инкубации фермента с АДФ оказывается заторможенным, подобно

*

1 При расчете константы диссоциации использовано уравнение для системы с взаимным истощением [641.

31

тому, как это происходит при использовании АТФ в качестве субстрата. Торможение реакции, индуцированное АДФ, требует ионов nMgr1"2 или других двухвалентных металлов.

АТФ-зависимая активация АДФ-блокированного фермента [48, 60]. Как было отмечено выше, если АТФазная реакция начинается добавлением фермента, преинкубированного с АДФ, к системе, содержащей АТФ и АТФ-регенерирующую систему, наблюдается лаг-фаза, а конечная скорость реакции спустя некоторое ¦ время достигает контрольных величин. Это означает, что диссоциация комплекса Е-АДФ происходит значительно медленнее, чем реакция, катализируемая свободным от ингибитора ферментом. Возможны два принципиально различных механизма активации фермента:

—АДФ ±АТФ

Е-АДФ «--> Е--> . ?АТФ • (4)

(фермент- медленно (свободный быстро (интермедиат ннгибиторный фермент) АТФазной реакции)

комплекс) kx

АТФ АДФ

Е-АДФ.--> АТФ-Е-АДФ.--- Е-АТФ . (5)

быстро медленно (интермедиат

(тройной . АТФазной реакции)

комплекс) к_г

В соответствии с моделью (4) АТФ способна образовывать фермент-субстратный комплекс только после диссоциации ингибитора •(АДФ). В случае (5) АТФ взаимодействует с фермент-ингибитор-мым комплексом, в результате чгго происходит отщепление ингибитора с образованием активного интермедиата АТФазной реакции. Следует подчеркнуть, что если первая схема требует участия в процессе активации единственного места связывания для нуклеотида (фермент

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.06.2019)