мости от коэффициента седиментации фермента и скорости вращения ротора.

Для подбора такого количества фермента, которое обеспечит изменение оптической плотности в данном растворе субстратов примерно на 1,0 (в полосовой двухсекторной ячейке), можно воспользоваться приближенной формулой:

Таблица 1

Начальная толщина полосы с ферментом (бг0) при разных объемах (f) в колодце и скорости вращения ротора в об/мин

с, мкл 5 10 15

бГо, СМ 0,015 0,031 0,046

Таблица 2

Время за которое полоса, образующаяся при v = 10 мкл, перемещается на свою толщину (0,031 см) в зависимости ots фермента и скорости вращения ротора в об/мин

s(S) Д/, мин 68 000 60 000 52 000

2 8,1 10,4 13,8

3 5,4 6,9 9,2 -

5 3,2 4,2 5,5

7 2,3 3,0 4,0

10 1,6 2,1 2,8

13 1,3 1,6 2,1

183

u=3,40-10-12n2s(S).

Здесь количество фермента и измеряется в единицах, определенных так, что в спектрофотометрической кювете с 3 мл того же раствора субстратов одна единица фермента вызывает изменение абсорбции на 0,01 за минуту (при длине оптического пути 1 см)$ п — скорость вращения ротора в об/мин; s(S) — коэффициент седиментации фермента в сведбергах. Если принято решение ог! раничиться в опыте изменением оптической плотности менее чем на 1,0, то надо соответственно уменьшить и.

После того как по этой формуле вычислено количество фермента, необходимо убедиться, что будет выполняться условие постоянства скорости реакции во всей полосе. Проще всего этс} сделать в спектрофотометре, проверив, постоянна ли активность выбранного количества фермента в заданном диапазоне оптической плотности.

Окончательное подтверждение правильности полученного результата можно получить только путем повторения полосовые опытов, варьируя концентрации (объем, заливаемый в колодецч сохраняют неизменным): в некотором диапазоне коэффициент седиментации воспроизводится с точностью не хуже +(2—3)%» а при дальнейшем увеличении концентрации быстро возрастает? из-за перегрузки полосы. Дополнительным критерием служит близость результатов вычислений, проделанных по методам полувысоты границы и разностных кривых.

Как уже отмечалось, в сопряженной системе лимитирующим скорость реакции фактором должен быть во всей полосе только-исследуемый фермент. Поэтому в таких экспериментах желатель-: но проверять соблюдение этого условия, проведя серию опытов по методу САФ, постепенно повышая концентрацию второго фермента (и третьего, если таковой участвует в сопряженной системе): в области, где скорость реакции лимитируют вспомогательные ферменты, значения коэффициента седиментации будут возрастать и стремиться к «насыщению», т. е. к коэффициенту седиментации исследуемого фермента [7].

В разделе «Теоретические и экспериментальные основы» было указано, что для получения правильных результатов важно, чтобы скорость реакции оставалась постоянной во времени в течение всего опыта. Для проверки следует построить график накопления продукта со временем и убедиться в его прямолинейности от начала до конца опыта. При любой постановке эксперимента для построения графика надо вычислить площади разностных кривых или промежутков между последовательно просканирован-ными границами седиментации (после перерисовки их с приведением к единому началу отсчета времени — см., например, [9]); возрастающую сумму этих площадей откладывают по оси ординат против соответствующих моментов времени на оси абсцисс. Такие расчеты и построения удобнее вести, если сканирование проводить через постоянные интервалы времени (2—8 мин в за-

184

яисимости от скорости вращения ротора и скорости седиментации фермента).

Если график оказывается искривленным к оси времени, то имеет смысл повторить опыты при других скоростях вращения ротора: гидростатическое давление в ячейке ультрацентрифуги лропорцонально квадрату угловой скорости [16], и поэтому, если имеет место увеличение изгиба графика при большей скорости, то это указывает на диссоциацию фермента на неактивные (или менее активные) субъединицы [10].

В заключение эксперимента, когда после всех перечисленных предосторожностей и проверок вычислено значение коэффициента седиментации sHa6ji, в него необходимо внести поправки на вязкость, плотность и температуру раствора субстратов в опыте по известной формуле

(jl) u) -L

V 420 lw\1\w If 1

- V20P20,B

b,2D.w — *набл '

где главные поправочные члены — отношение вязкости воды (ш) при температуре опыта к вязкости при 20° С и относительная вязкость раствора при температуре опыта; меньшую роль играет поправка на плотность, где рго.ю плотность воды при 20° С, pt — плотность раствора при температуре опыта, V20 и V< — парциальный удельный объем фермента при 20° С и_при температуре опыта соответственно (если известно значение V при какой-либо температуре I, то при U объем Vt, s V*, О + ^" Ю~* (^а — ¦

Примеры, экспериментов со сложными ферментами. Изучение сложных ферментов с помощью метода САФ позволяет в некоторых случаях выяснить роль четвертичной структуры в их каталитической функции.

Тейлор с сотр. [17] применяли метод САФ для исследования пируваткарбоксилазы (ПКК) из печени цыпленка и крысы. Опыты проводили в сопряженной системе с малатдегидрогеназой. Для создания градиента плотности реакционная среда содержала 50% D20. Скорость вращения ротора составляла 52 000 об/мин'.

Были обнаружены две активные формы ПКК цыпленка с коэффициентами седиментации 16 S и 22 S. Интересно отметить, что обе формы наблюдались одновременно, но без твердых указаний на наличие обратимой реакции ассоциации — диссоциации между ними. Добавочные опыты с обычной скоростной седиментацией при большой концентраци белка позволили авторам заключить, что 22 S компонента не является артефактом из-за возможной перегрузки полосы. В работе делается вывод, что 16 S — это тет-рамеры, а 22 S — октамеры 7 S субъединиц.

Пируваткарбоксилаза из печени крысы также седиментирова-ла двумя активными формами, но в разных средах: в присутствии ацетил-СоА с s=16,3S, а без этого активатора — с s=12,3.S. Переход из 16 S- в 12 5-форму происходил и при увеличении ион-

185

ной силы (КНСОз). Авторы полагают, что быстрая форма представляет собой тетрамеры, а медленная — димеры.

Еще один интересный результат этой работы заключается в том, что в отсутствие ацетил-СоА ни одна форма ПКК из печени цыпленка не обладает активностью, в то время как оба олигомера ПКК крысы (и даже ее мономер) активны, хотя и в меньшей мере, чем при наличии активатора.

Важные данные получены методом САФ для фосфофруктокиназы (ФФК) из мышцы кролика [5, 18]. Опыты проводили в сопряженной системе с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена--зой+триозофосфат изомеразой, а также с рН-индикатором «крезол красный». В первом случае удельная активность ФФК составляла 190 ед./мг, во втором — 90 ед./мг. Скорость вращения ротора была 60 000 об/мин. Коэффициент седиментации активной ФФК s2o,a.= 12,2S в тех и других опытах [18]. В следующей работе [5] было, кроме того, установлено, что в отсутствие су