Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

я их устранения.

Рис. 3. Условие стабилизации полосы с ферментом посредством градиента плотности.

1 -— градиент плотностн и плотность фермента в полосе; 2— градиент (линейный) плотности и плотность низко-молекулярного вещества (подробности в тексте); 3 — суммарный градиент плотности и плотность. А — градиенты, Б — интегральные кривые

180

j Измерение коэффициента седиментации

Измерение коэффициента седиментации в опытах по методу САФ можно произвести разными способами. Математически строгие подходы описаны в [8, 11]. Мы ограничимся здесь указанием на два приближенных способа, широко использующихся и приводящих к вполне удовлетворительным результатам.

Способ разностных кривых [7]. Границы седиментации на рис. 2 А и 2 Б являются функциями координаты г и параметра t — момента времени, когда производилось данное сканирование At (г). Разностная кривая

Ц+"{г)=А1+А{(г)-А,{г),

полученная вычитанием в каждой точке г двух последовательно просканированных с интервалом времени At границ, характеризует накопление продукта за этот интервал времени (если Af достаточно мало, чтобы седиментацией и диффузией продукта можно было пренебречь). Предполагая, что каждая молекула фермента в любом месте полосы реагирует с субстратом с одинаковой скоростью, легко заключить, что максимум разностной кривой совпадает с максимумом распределения фермента в полосе в момент времени t+Mj2. Поэтому коэффициент седиментации вычисляется по обычной формуле s=Alnr/o2Af из графика зависимости In г от t [1, 2].

Способ деления границы пополам [8]. В тех случаях, когда границы седиментации достаточно симметричны, максимуму полосы (координате f(t)) соответствует полувысота границы. Если снизу и сверху граница имеет горизонтальные плато, полувысота есть просто половина расстояния между плато [8]. Если же симметрия границы почему-либо нарушена и одно или оба плато отсутствуют, то можно прибегнуть к «способу прозрачной линейки» [2], найти середину квазилинейного участка границы и принять координату этой точки за искомую координату г. Ошибка в величине 5 при этом, конечно, возрастает, но остается все же в пределах ±5% (при том условии, что все перечисленные выше требования к проведению опыта удовлетворены).

Неправильное определение 5 при чрезмерной активности фермента в полосе

Грубая ошибка может быть допущена при измерении s, если концентрация активного фермента столь велика, что где-то внутри полосы концентрация субстрата падает до такого уровня, когда уже не фермент, а субстрат начинает лимитировать скорость реакции. Это деформирует границу седиментации таким образом, что во фронтальной части полосы граница на ленте самописца ультрацентрифуги круто поднимается вверх, а затем полого выходит на нижнее плато. Точка перегиба с координатой t оказывается смещенной вперед относительно вершины кривой распреде-

181

ления фермента в полосе и соответственно завышена величина .коэффициента седиментации. Эта погрешность может составлять десятки процентов.

Необходимо, однако, указать на работу [12], теоретически и экспериментально расширившую рамки метода САФ в область больших (до 1 мг/мл) концентраций активного фермента. Это-открывает новые возможности для изучения концентрационной зависимости ассоциации — диссоциации и инактивации много» субъединичных ферментов (см. также [13]).

Ферменты сопряженной системы

При выборе сопряженной системы для опытов по методу САФ необходимо обеспечить выполнение двух условий. Во-первых, ферменты такой системы должны иметь заметно меньший коэффициент седиментации по сравнению с изучаемым ферментом. Так„ например, при исследовании пируваткиназы, у которой s=9,7 s, в качестве сопряженного фермента можно взять лактатдегидроге-назу с s=7,0 5, благодаря чему она не будет опережать седиментацию пируваткиназы. Во-вторых, сопряженные ферменты следует брать в такой высокой концентрации, чтобы они ни в коем случае не лимитировали суммарную реакцию.

Техника эксперимента

На рис. 1 показан двухсекторный сердечник для полосового> опыта. Сердечник выполнен из эпоксидной смолы с древесным углем в качестве наполнителя, придающего сердечнику добавочную прочность и черный цвет. Боковые круглые отверстия представляют собой колодцы с дном и вмещают до 20 мкл жидкости. Узкие и мелкие канавки соединяют колодцы с обычными сквозными секториальными прорезями (так называемыми «секторами»). Секторы в свою очередь соединены друг с другом канавками, пересекающими перегородку на обоих концах. Кроме того, секторы имеют в своей узкой части, как обычно, тонкие каналы (не видны на рисунке) для заполнения в собранной ячейке.

Подготовку ячейки для САФ производят следующим образом. Сердечник помещают отверстиями колодцев кверху в корпус ячейки на уже установленное на свое место нижнее окно. В правый колодец микрошприцем вводят 10—15 мкл фермента в легком буфере, левый наполняют таким же объемом буфера либо оставляют пустым. После этого осторожно, следя за тем, чтобы из-колодцев не выдавились растворы, вставляют оправу с верхним окном и заканчивают сборку ячейки. Если секторы сохранились в чистоте, в правый сектор (сектор А) вводят 0,33—0,35 мл раствора субстратов в буфере с повышенной плотностью. В левый сектор (сектор В) помещают либо такой же объем, либо, если левый колодец оставлен пустым, соответственно больший объем тяжелого буфера. Субстрат, изменяющий под действием фермен-

182

та свою оптическую плотность, или рН-индикатор вводят в сек-Чгор А или в оба сектора с таким расчетом, чтобы при сканировании получить границы того или иного типа из представленных на рис. 2.

В качестве низкомолекулярного вещества применяют глицерин (5%) [9], D20 (50%) [14], NaCl (0,1 М) или (в опытах без рН-индикатора) буферные соли (0,1 М) [8, 15].

Количество наслаиваемого фермента подбирают, исходя из его удельной активности, ожидаемого коэффициента седиментации, Объема, который будет налит в колодец, скорости вращения ротора и экстинкции того из реагентов, который изменяет в ходе реакции оптическую плотность раствора. Ориентироваться при этом следует на такую активность в ячейке, чтобы за время седиментации фермента на ширину зоны оптическая плотность изменялась не менее чем на 0,25 ед. и не более чем на 1,00 [7]. Скорость вращения должна быть максимальной, чтобы седиментация происходила быстрее, чем диффузионное расплывание полосы. (Последнее протекает в полосовых опытах намного быстрее, чем в обычных [4]; так, в опыте с глюкозо-6-фосфат дегидрогеназой в центре полосы концентрация через 40 мин составляла всего 27% от начальной [7]). Однако для ферментов с большим коэффициентом седиментации скорость вращения должна позволить произвести по меньшей мере 6 сканирований с интервалом не менее времени перемещения полосы на свою толщину. Для ориентировочных расчетов при подготовке опытов в табл. 1 •приводится начальная толщина полосы при разных объемах фермента, вычисленная из геометрических соображений, а в табл. 2 — время перемещения полосы (образующейся при объеме 10 мкл) на свою толщину (0,031 см) в зависи

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)