полосу» с ферментом. Для эффективного протекания этого процесса самогенерации градиента в качестве низкомолекулярных веществ применяют нейтральную соль, D2O, глицерин и т. п., но не сахарозу, у которой для таких опытов недостаточно велик коэффициент диффузии.

Ультрацентрифугирование с самогенерирующимся градиентом плотности в отличие от зонального было названо «по- Рис j Двухсекторный сер-лосовым» (band), и так же называ- дечник типа I для полосо-ются специальные сердечники к анали- вого аналитического ультра-тическим ячейкам [4, 6]. Чаще всего центрифугирования используют двухсекторные полосовые

сердечники типа I (рис. 1), и опыты проводят в двухлучевом режиме. Низкомолекулярное вещество, создающее градиент плотности, обязательно присутствует в обоих секторах.

Регистрация седиментации активного фермента. Регистрация седиментации активного фермента осуществляется разными способами в зависимости от тех изменений в растворе, которые влечет за собой реакция.

Случай 1: в результате реакции оптическая плотность "среды уменьшается. Примером может служить восстановление пирувата лактатдегидрогеназой с одновременным окислением НАДН. Как пируват, так и НАДН вводят лишь в тот сектор, в котором будет-

177

седиментировать лактатдегидрогеназа (сектор А). Поэтому на длине волны поглощения НАДН (максимум при 340 нм) начальная оптическая плотность будет определяться исходной концентрацией НАДН (e'XiM1CM = 6»22)- По мере продвижения фермента оптическая плотность понижается и последовательное сканирование дает между областью, где НАДН уже окислен до НАД+, и областью с исходным НАДН систему границ (рис. 2 А). Каждая граница соответствует положению зоны с ферментом в момент сканирования.

Направление седиментации

Направление седиментации д 2

Рис. 2. Два типа седиментационных диаграмм в опытах по методу САФ с митохондриальной Н+АТФазой из сердца быка. А — совмещенные сканы границ седиментации в опыте с сопряженной системой « окислением НАДН; Б— опыт с рН-индикатором «нейтральный красный»; В, Г — графики для вычисления коэффициентов седиментации по методу разностных кривых (2) и по полувысоте границ (1), соответствующие опытам А и Б

Случай 2: оптическая плотность среды возрастает. Это может иметь место, если, например, зона с лактатдегидрогеназой седиментирует через среду, содержащую достаточно много лак-тата и НАД+, в результате чего лактат окисляется до пирувата, а НАД+ восстанавливается до НАДН. В таком опыте ячейку можно снаряжать так же, как в случае 1, но лучше вводить лактат и НАД+ в оба сектора, чтобы более уверенно фиксировать базовый уровень.

Седиментационные диаграммы в этом случае имеют в принципе тот же вид, что и на рис. 2 Л, но как если бы седиментация происходила справа налево.

178

Случай 3: фермент-субстратная реакция приводит к изменению рН среды. Пример — гидролиз АТФ митохондриальной Н+ АТФазой. Изменение рН среды можно с помощью подходящего индикатора преобразовать в изменение оптической плотности* | области длин волн, характерных для данного индикатора. На. ¦ис. 2 Б приведена последовательность границ седиментации по-юосы Н+АТФазы в присутствие субстрата Mg-АТФ и рН-индика-жора «нейтральный красный». В обоих секторах полосовой ячейки, находились и субстрат, и индикатор.

Для таких исследований рН-индикатор должен обладать дву-мя обязательными качествами: во-первых, ие влиять на активность и физико-химические свойства фермента; во-вторых, оптическая плотность реакционной среды с этим индикатором должна уменьшаться или возрастать при каждом ферментном акте («обороте» фермента) на одну и ту же величину при всех значениях рН в седиментирующей полосе фермента.

Подобрать такой рН-индикатор весьма не просто. Кроме ¦ого, при высокой скорости вращения ротора любой индикатор* Неизбежно во время опыта перераспределится в ультрацентрифужной ячейке в соответствии со своими коэффициентами седиментации и диффузии, что в большей или меньшей степени исказит «абсорбционную седиментограмму. Все это побуждает применять-в опытах с ферментами, которые сами не изменяют оптической •длотности реакционной среды, сопряженные фермент-субстратные системы, подобранные так, чтобы выполнялись оба указанные условия. Пример такой системы будет приведен в разделе «Некоторые результаты применения метода САФ».

Успешное проведение экспериментов по САФ требует соблюдения ряда предосторожностей.

Стабильность полосы. Прежде всего необходимо обеспечить стабильность полосы с ферментом. Чтобы избежать появления конвекции, которые исказят форму границы и сделают невозможным измерение коэффициента седиментации, должно быть соблюдено условие [7], связывающее суммарный градиент плот-

/ dp \

ности в седиментирующей полосе i— 1 с его составляющими:

самогенерирующимся градиентом плотности низкомолекулярного вещества, диффундирующего из реакционной среды в полосу

¦с ферментом • и градиентом плотности самого фермента

R

в этой полосе

др_

дг

( дг )нм ( дг )е ^" ^'

Физический смысл этого условия, графически изображенного на-рис. ЗА, становится понятным из соответствующих интегральных кривых на рис. ЗБ: суммарная плотность раствора нигде в ячейке не должна убывать с увеличением расстояния г от оси враще-

179-

иия ротора. В противном случае фермент будет «проваливаться» на переднем крае полосы и возникнет конвекция Чтобы избежать этого, надо правильно выбрать наслаиваемый объем и концентрацию фермента, а также концентрацию низкомолекулярного ве щества.

Постоянство скорости реакции. Следующим важным требова нием является постоянство скорости ферментативной реакции в пределах всей полосы.

Если реакция необратима, то удовлетворить этому требованию •с достаточной точностью можно взяв такие концентрации субстрата и фермента, чтобы при продвижении полосы концентрация

субстрата [S] уменьшалась 5 менее чем на 10%. Ограни-

] чившись такой глубиной реакции, в случае кинетики Михаэлиса—Ментен легко рассчитать, что при [S]0> >3Km скорость реакции на хвосте полосы будет менее чем на 3% ниже скорости на фронте, что в ряде случаев вполне допустимо.

Для обратимой реакции положение усложняется тем, что на хвосте полосы, в отличие от переднего края, присутствует определенное количество продукта, и в результате скорость реакции может заметно снизиться Чтобы этого не произошло, в среде создают очень высокую начальную концентрацию субстрата, например 20 Кт [7].

Скорость реакции может уменьшаться в пределах полосы, если продукт является сильным ингибитором, или возрастать, если ингибирующими свойствами обладает находящийся в избытке субстрат.

Наконец, скорость реакции понижается со временем, когда в ходе опыта происходит денатурация фермента. Активность мно-госубъединичных ферментов может падать из-за диссоциации на субъединицы под влиянием гидростатического давления, быстро возрастающего в полосе по мере ее седиментации ко дну ячейки [9, 10]. Все эти факторы, искажающие правильный ход опытов, следует уметь распознавать и принимать меры дл