етрамерной ЛДГ на неактивные димеры и мономеры субъединиц [39].

Для определения парциального мольного объема ассоциации субъединиц AVS согласно (24) и (26) необходимо проводить измерения v после достижения равновесия при разных давлениях. Это не входило в цель данной работы, так как не требует быстрого запуска реакции под давлением — главного назначения описанного прибора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Johnson F. Н., Eyring Н., Stover В. J. (1974) in The Theory of Rate Processes in Biology and Medicine, p. 273—369, Wiley, N. Y.

2. Jaenicke R. (1981) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10, 49—67.

3. Lai dler K. J. (1951) Arch. Biochem. 30, 226—236.

4. La idler K- J., Bunting P. S. (1973) The Chemical Kinetics of Enzyme Actions (2nd edn.), p. 471, Clarendon Press, Oxford.

5. Harrington W. F., Kegeles G. (1973) Methods Enzymol. 27, 306—345.

6. Kegeles G., Rhodes L., BethuneJ. L. (1967) Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 58, 45—51.

7. ChernyakV. Ya., Kozhanova Z. E., Chernyak В. V., Kozlov I. A_ (1979) Eur. J. Biochem. 98, 585—589.

8. TenEyck L. F., KauzmannW. (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58_ 888—894.

9. Heremans K. (1979) in High Pressure Science and Technology, v. 1 (Tim-merhaus K. D. and Barber M. S., eds.), p. 699—705.

10. Mori Id E. (1981) Advances Protein Chem. 34, 93—166.

11. Эмануэль H. M., Кнорре Д. Г. (1969) Курс химической кинетики. 2-е изд. Высшая школа, М.

12. Гоникберг М. Г. (1969) Химическое равновесие и скорость реакций при. высоких давлениях. 3-е изд. Химия, М.

13. Kratky О., Leopold Н., Stabinger Н. (1973) Methods Enzymol. 27, 98—110.

174

14. Эдсалл Дж. (1956) в кн. Белки (ред. Г. Нейрат, К- Бэйли), т. 2, с. 191, ИЛ, м.

15. Kuntz I. D. Jr., Kauzmann W. (1974) Advances Protein Chem. 28, 239_345.

16. Ne me thy G., Peer W.J, Scheraga H. A. (1981) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10, 459—497.

17. Asa no Т., le Noble W.J. (1978) Chem. Rev. 78, 407—489.

18. Chernyak В. V., Chernyak V. Ya., Gladysheva Т. B. et al. (1981) Biochim. Biophys. Acta 635, 552—570.

19. Penniston J. T. (1971) Arch. Biochem. Biophys. 142, 322—332.

20. Paladini A. A., Weber G. (1981) Biochemistry 20, 2587—2593.

21. M filler K-, Ludemann H.-D., Jaenicke R. (1981) Biochemistry 20, 5411—5416.

22. Johnson F. H., EyringH. (1970) in High Pressure effects on cellular processes, p. 1—44, Acad. Press, N. Y.

23. Mustafa Т., Moon Th. W., Hochachka P. W. (1971) Amer. Zool. 11, 451—466.

24. Schmid G., Liidemann H.-D., Jaenicke R. (1975) Biophys. Chem. 3, 90—98.

25. Carter J. V., Knox D. G., Rosenberg A. (1978) J. Biol. Chem. 253, 1947—1953.

26. Schade В. C, Rudolph R., Ludemann H.-D., Jaenicke R. (1980) Biochemistry 19, 1121—1126.

27. Шаховской Г. П., Эльянов Б. С, Прохоров Н. И. (1972) Приборы и техника эксперимента, № 2, 164—166.

28. Grieger R. A., Eckert С. А. (1970) AJChE J. 16, 766—770.

29. Kegeles G. (1978) Methods Enzymol. 48, 308—320.

30. Heremans K-, Snauwaert J., Rijkenberg J. (1980) Rev. Sci. In-' strum. 51, 806—808.

31. Черняк В. Я-, Драчев В. А. (1983) Бюллетень открытий и изобретений, № 26, 134—135. Авт. свидет. № 1029014.

32. Moon Т. W., Mustafa Т., Hochachka P. W. (1971) Amer. Zool. 11, 473—478.

33. Schmid G., Ludemann H.-D., Jaenicke R. (1978) Eur. J. Biochem. 86 219_224.

34. Swezey R. R., Somero G. N. (1982) Biochemistry 21, 4496—4503.

35. Jaenicke R., Knof S. (1968) Eur. J. Biochem. 4, 157—163.

36. Schade В. C, Ludemann H.-D., Rudolph R. et al. (1980) Biophys. Chem. 11, 257—263.

37. Hard man M. J., Coates J. H., Gutfreund H. (1978) Biochem. J. 171, 215—223.

38. Duggleby R. G., Morrison J. F. (1977) Biochim. Biophys. Acta 481, 297—312.

39. Schmid G., Ludemann H.-D., Jaenicke R. (1979) Eur. J. Biochem. 97, 407—413.

СЕДИМЕНТАЦИЯ АКТИВНОГО ФЕРМЕНТА

В. Я. Черняк

(Межфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского МГУ)

Коэффициент седиментации фермента определяют обычно в аналитической ультрацентрифуге методом скорости седиментации [1, 2]. Для этих опытов необходимо располагать примерно 1 мг фермента довольно высокой степени чистоты — не менее 90%. Концентрацию белка даже в ультрацентрифуге с фотоэлектрической абсорбционной сканирующей системой с трудом удается снижать до —50 мкг/мл, и поэтому в ряде случаев для экстраполяции коэффициента седиментации к бесконечному разбавлению приходится проводить серию опытов с различными концентрациями.

В 1963 г. Коэн [3] предложил наслаивать в границеобразую-щей ячейке клапанного типа небольшой объем раствора фермента на более плотный буферный раствор с субстратами и регистрировать седиментацию зоны, содержащей фермент. Если в результате ферментативной реакции изменяется оптическая плотность раствора, то с помощью абсорбционной оптики можно даже в грубом экстракте наблюдать седиментацию одного лишь интересующего нас фермента: в месте его встречи со своими субстратами оптическая плотность будет либо возрастать, либо уменьшаться. Таким образом, для определения коэффициента седиментации нет необходимости добиваться высокой степени гомогенности ферментного препарата.

Особый интерес придает этому методу его главная особенность — непрерывная фермент-субстратная реакция в течение всего опыта в ультрацентрифуге, из-за чего метод и получил название «седиментация активного фермента» (САФ). Поэтому коэффициент седиментации, определенный в таких опытах, отражает динамическое состояние реагирующего фермента и может отличаться от коэффициента седиментации, измеренного в обычных опытах без субстрата [5].

В дальнейшем САФ стали проводить в ячейках, разработанных для «полосового» аналитического ультрацентрифугирования [4, 6] в ультрацентрифугах с фотоэлектрической абсорбционной сканирующей системой [2]. Эти ячейки позволили уменьшить необходимое количество фермента до долей микрограмма, а сканирующая система существенно упрощает обработку седиментаци-онных диаграмм.

176

Наряду со многими достоинствами метод САФ может приводить к таким ошибкам, которые несвойственны обычным методам седиментационного анализа и которые могут происходить из-за неправильной постановки эксперимента [7, 8] или из-за особых свойств изучаемого фермента [9].

В этой статье мы кратко изложим теоретические и экспериментальные основы метода САФ и опишем главные источники возможных артефактов.

Теоретические и экспериментальные основы

В обычном зональном препаративном ультрацентрифугировании: стабильность наслоенной зоны с биополимерами обеспечиваете» предсозданным градиентом плотности. Наиболее широко для этого применяют сахарозу.

В методе САФ тонкий слой забуференного раствора фермента в начале опыта (при скорости вращения ротора 1000— 2000 об/мин) наслаивается на однородный раствор субстратов-в том же буфере, но с добавленным низкомолекулярным веществом. Стабилизация достигается также с помощью градиента плотности, но в этом случае он образуется уже после наслоения благодаря диффузии низкомолекулярного вещества в слой — «