ением 1000 атм. «Спекорд УФ-ВИЗ», 340 нм, 25°С; 0,2 М трис-HCl буфер: рН 7,5, 10 мМ ди-тиоэритритол, 1 мМ ЭДТА, 0,4 мкг/мл ЛДГ, 0,8 мМ пируват Na, 0,16 мМ НАДН. Надписи Г, 3' и 10' указывают на экспозицию фермента под давлением 1000 атм до начала реакции (время в минутах)

Описанное устройство позволяет варьировать условия проведения эксперимента. Так, например, помещая в чашечку субстрат, а фермент вводя с самого начала в раствор, заполняющий ячейку, можно выдерживать нужное время фермент под давлением без контакта с субстратом. Если при этом активность фермента изменяется, то после начала реакции сразу выясняется, оказывает ли данный субстрат стабилизирующее действие (см. с. 173).

Устройство дает возможность исследовать квазирелаксационную кинетику при быстром (~5 с) повышении или понижении давления в ходе реакции. Правда в таких опытах относительно быстрое изменение давления приводит и к температурному скачку, но это неустранимая особенность релаксационных опытов: как

171

уже отмечалось, адиабатическое изменение температуры составляет 27ю00 атм.

Описываемый вариант кюветы не имеет встроенного термодатчика, и температурный режим калибровали в специальных опытах по ртутному термометру, погруженному в заполненную водой и подключенную к ультратермостату кювету высокого давления. Многократные измерения позволяют заключить, что точность установки температуры в кинетических опытах составляла ±0,3° С. Время, необходимое для выравнивания температуры на заданном уровне после быстрого (5 с) повышения давления от 1 до 1000 атм, можно свести примерно к 1 мин, если кювета была предварительно термостатирована.

Величина давления измеряется контрольным манометром с ценой деления 10 атм.

Кинетика лактатдегидрогеназной реакции под гидростатическим давлением

Для первых исследований в кювете высокого давления, разработанной в Межфакультетской лаборатории им. А. Н. Белозерского МГУ, была избрана лактатдегидрогеназа из мышц кролика (ЕС 1.1.1.27), сокращенно ЛДГ-М4. Она является одним из наиболее изученных ферментов гликолитического цикла и, что для нас было особенно важно, интенсивно исследовалась с применением высокого гидростатического давления [24, 26, 32—35].

ЛДГ состоит из четырех субъединиц, ковалентно не связанных между собой, и поэтому потенциально способна диссоциировать под давлением, если определенный согласно формуле (25) парциальный мольный объем ассоциации AVs>0. Действительно, как показано в [26, 36], после 20 мин выдержки при 2000 атм ЛДГ-М4 (из мышцы свиньи) диссоциирует на лишенные активности мономеры. Кроме того, оказалось, что при Р^ЮОО атм диссоциация и инактивация полностью обратимы. Исследовав кинетические и равновесные характеристики этих реакций, авторы [26] нашли, что для холо-ЛДГ-М4 из мышцы свиньи парциальный активационный объем диссоциации AV^=—231 мл/моль, а парциальный объем реакции диссоциации ДК=—390 мл/моль.

В наших опытах использовалась лактатдегидрогеназа из мышц кролика (ЛДГ-М4) («Серва») с удельной активностью 550 ИЕ/мг. В качестве буфера был избран трис («Сигма»), поскольку в нем мал эффект давления на рН [37]. Стандартная реакционная среда состояла из 0,2 М трис-НС\ буфера рН 7,6, 10 мМ дитиоэритритола («Серва»), 1 мМ ЭДТА («Реанал»), 0,8 мМ пирувата Na («Сигма») и 0,16 — 0,2 мМ НАДН («Реанал») .

Концентрация ЛДГ-М* составляла 0,093 мкг/мл в опытах при 1 атм и 0,372 мкг/мл в измерениях при 1000 атм. Эти концентрации фермента были подобраны так, чтобы начальные скорости

172

реакций при 1 атм и при 1000 атм не сильно различались и составляли примерно ^0,1 ед. оптической плотности (340 нм) в мин. Все опыты проводили при 25° С в диапазоне давлений от 1 атм до 1000 атм.

Изменение оптической плотности в процессе лактатдегидроге-назной реакции регистрировали в модифицированном спектрофотометре «Спекорд УФ-ВИЗ» (Цейсе, ГДР). Модификация была направлена на то, чтобы получить возможность измерять изменения оптической плотности с максимальной для данного прибора чувствительностью — примерно 0,1 ед. оптической плотности на шкалу (в диапазоне 80—100% пропускания) — при начальной оптической плотности 1—1,2. Для решения этой задачи в линию •сравнения спектрофотометра в кюветном отделении вставляли круговой оптический ослабитель. Управление ослабителем вывели наружу, так что его положение можно быстро изменять при закрытой крышке кюветного отделения и компенсировать исходную абсорбцию реакционной среды. Это позволило измерять начальные скорости реакции при достаточно высокой концентрации НАДН (Кт=П мкМ [38]) и небольшой глубине превращения субстрата (менее 2% пирувата). На рис. 2 показана типичная запись кинетики лактатдегидрогеназной реакции для определения начальной скорости. В описанных условиях кинетика, как показали контрольные опыты, оставалась линейной не менее 10 мин.

На рис. 3 представлен один из экспериментальных графиков за-

U, мкмоль НАДН/мин

0,055-0,05

ОМ

0,03

0,01

0,01

| i i ' i

12345

10

_|_

15

t,MUH

держки под давлением 1000 атм до пуска реакции

Рис. 3. Зависимость активности висимости активности ЛДГ от лдг от продолжительности вы-времени при давлении 1000 атм. Отрезки горизонтальных прямых, которые начинаются в момент

запуска реакции, показывают, что при взаимодействии с пирува-том ЛДГ из мышц кролика приобретает устойчивость к давлению (по крайней мере в присутствии достаточного количества пирувата).

Пунктиром на рис. 3 показана экстраполяция экспериментальных данных к моменту приложения давления (г=0). Как видно, найденная таким способом «начальная скорость иР'=0— —0,053 мкмоль НАДН/мин уже существенно отличается от vP=G = = 0,091 мкмоль НАДН/мин, измеренной при тех же условиях, но при 1 атм. Падение 1^г° по сравнению с иР=0 происходит со скоростью, которая превышает возможности наблюдения нашим методом й либо характеризует первую фазу воздействия высокого

173

давления на ЛДГ, либо в исследовавшейся серии фермента присутствовала фракция с повышенной пьезолабильностью.

На отрезке времени от 1 до 5 мин инактивация происходит с измеримой кинетикой первого порядка, но тем не менее с очень высокой константой скорости 37,5-Ю-4 с-1. Это примерно в 60 раз больше, чем наблюдали в своих опытах с ЛДГ из мышц свиньи Шаде и др. [26]. Вероятнее всего причина заключается в значительно более низкой концентрации ЛДГ в наших опытах, из-за. чего фермент был менее стабилен. Действительно, в то время как в [39] фермент при с=2,5 мкг/мл за 150 ч стояния при 1 атм терял всего 20% активности, в нашем растворе с концентрацией

0. 3 мкг/мл активность падала на 40% за 19 ч.

В заключение отметим, что после декомпрессии частично активированной ЛДГ немедленного возрастания активности не наблюдается. Между тем согласно (5) если активационный объем AV^ ферментативной реакции отличен от нуля, то сразу после снятия давления константа скорости реакции должна вернуться к значению ko. Следовательно, в наших опытах с ЛДГ AV^—0, а инактивация под давлением происходит только из-за диссоциации т